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红系分化是指造血干细胞经过多能造血干细胞、髓样祖细胞、红系祖细胞,形成成熟红细胞的过程,是机体产生成熟红细胞的重要途径。白血病的成因一般被认为是红系祖细胞的的发育和分化停滞。慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种多能造血干细胞恶性克隆增殖性疾病,具有凋亡阻滞、增殖失控、造血功能抑制及分化障碍等特征。因此对白血病细胞分化诱导和作用机制的深入研究以及诱导分化新靶点的发现可为白血病的治疗提供新的理论基础和依据。信号接头蛋白CRKL是CRK家族成员之一,可以通过其SH2、SH3结构域募集信号通路分子。CRKL的异常表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关,可能是潜在影响肿瘤治疗和预后的靶标分子。本组前期结果表明CRKL差异表达影响K562的增殖、迁移、侵袭和红系分化、巨核分化能力;我们用CRKL稳定敲降的K562细胞通过基因芯片和蛋白组学筛选和鉴定了与红系分化相关分子的表达均升高,提示CRKL与K562细胞红系分化相关。miR-200家族中的miR-429是一种具有组织和细胞特异性的miRNA,在不同肿瘤中发现miR-429的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。本组前期结果表明:在研究肝癌Hep G2细胞迁移、侵袭过程中发现miR-429与CRKL存在靶向调控关系,二者表达水平呈负相关,并且主要通过ERK通路起作用。但miR-429在白血病细胞红系分化中的作用及机制尚不清楚。所以本论文主要研究miR-429与CRKL靶向作用调控白血病细胞红系分化的分子机制,为白血病分子靶向治疗提供新的研究线索和思路。目的:1.在CML患者样本中检测miR-429与CRKL的表达。2.筛选CRKL表达相关的红系分化相关分子3.明确miR-429、CRKL对K562红系分化的影响;4.探讨miR-429靶向CRKL调控K562红系分化的分子机制。方法:1.qRT-PCR检测CML临床样本中miR-429与CRKL的表达及其相关性;2.基因芯片筛选CRKL稳定敲降后K562细胞中表达变化的红系分化相关分子;3.联苯胺染色法检测Hemin处理K562细胞的红系阳性率;4.qRT-PCR检测Hemin处理K562细胞24 h和48 h后红系分子表达;5.qRT-PCR和Western blot（WB）检测miR-429和CRKL在Hemin诱导24 h和48 h后K562细胞中的表达水平;6.用Lipofectamine TM 2000及Letran-R方法分别在K562细胞中瞬时转染PCDH-CRKL及PCDH质粒、miR-429 inhibitor及miR-NC inhibitor。WB和qRT-PCR分别检测CRKL和miR-429的表达水平;7.联苯胺染色法检测miR-429和CRKL水平变化对细胞红系分化的影响;8.qRT-PCR法检测miR-429和CRKL对K562红系分子表达的影响;9.CCK-8法检测miR-429和CRKL对K562增殖的影响;10.流式细胞术检测miR-429对K562细胞红系分子GPA和CD71表达的影响;11.WB法检测miR-429高、低表达和CRKL高表达对K562细胞中CRKL和p-CRKL表达的影响对ERK通路蛋白Raf、p-Raf、MEK、p-MEK、ERK1/2、p-ERK1/2和Ras表达的影响;12.用PD98059抑制ERK通路,WB、联苯胺染色法和qRT-PCR分别检测miR-429和CRKL对K562细胞中ERK和p-ERK的表达,对K562红系分化的影响。结果:1.与正常外周血样本相比,CML初发患者骨髓样本单核细胞中miR-429表达降低1.1倍（P=0.0269）,CRKL表达升高4.45倍（P=0.0208）,二者负相关（R2=0.424,P=0.0301）。2.CRKL稳定敲降后,基因芯片数据结果表明与红细胞生成相关SPTA1、SPTB、TFRC、PKLR、EPB41L3、AHSP、RHD、RHCE水平在K562中分别升高1.50、1.64、1.76、1.82、1.90、2.20、1.94和2.06倍。3.50μM Hemin诱导K562细胞24和48 h之后,红系分化率分别上升36.5%（P=0.0036）和85.9%（P=0.0034）;红系分子γ-globin、ε-globin、GPA、α-globin的表达与0 h相比,在24 h分别升高3.2倍（P=0.0152）、1.0倍（P=0.0416）、2.4倍（P=0.0064）、1.9倍（P=0.0095）,在48 h分别升高3.5倍（P=0.0020）、0.86倍（P=0.0107）、2.1倍（P=0.0040）、1.5倍（P=0.0008）。4.qRT-PCR结果表明miR-429在40μM Hemin处理24 h和48 h的K562中表达水平则升高43.5%（P=0.0279）和123.0%（P=0.0011）;WB结果表明CRKL分别降低28.7%（P=0.0008）和37.7%（P=0.0072）。5.与miR-NC inhibitor转染细胞相比,miR-429 inhibitor转染K562细胞对40μM Hemin诱导的红系分化率降低51.4%（P<0.0001）;与PCDH转染相比,PCDH-CRKL转染K562细胞产生的红系分化率降低47.2%（P<0.0001）。6.与miR-NC inhibitor转染细胞相比,miR-429 inhibitor转染细胞中γ-globin、ε-globin、HBA分别降低61.3%（P=0.0005）、78.9%（P=0.0020）、44.6%（P=0.0226）;与PCDH转染细胞相比,PCDH-CRKL转染细胞中γ-globin、ε-globin、HBA分别降低55.3%（P=0.0034）、76.8%（P<0.0001）、92.1%（P<0.0001）。7.CCK-8法分析表明:与miR-NC inhibitor转染细胞相比,在24 h,48 h,72h时,miR-429 inhibitor转染细胞增殖能力分别升高10.3%（P=0.0020）,16.5%（P<0.0001）,61.1%（P<0.0001）;与PCDH转染细胞相比,PCDH-CRKL质粒转染细胞增殖能力分别升高18.2%（P=0.0010）,40.4%（P<0.0001）,25.7%（P<0.0001）。8.流式细胞术结果表明:与miR-NC mimic转染细胞相比,miR-429 mimic转染K562细胞中CD71和CD235a（GPA）双阳性细胞群占比增加42.5%。9.与miR-NC mimic转染细胞相比,miR-429 mimic转染K562细胞中CRKL表达降低39.3%（P=0.0006）,p-CRKL降低42.0%（P=0.0058）;p-Raf、p-MEK、p-ERK分别增加71.3%（P=0.0034）、47.5%（P=0.0306）、67.7%（P=0.0004）。与miR-NC inhibitor转染细胞相比,miR-429 inhibitor转染K562细胞中CRKL升高34.7%（P<0.0001）,p-CRKL升高83.0%（P=0.0041）;p-Raf、p-MEK、p-ERK表达分别降低33.0%（P=0.0071）、35.3%（P=0.0045）、46.3%（P=0.0025）。与PCDH转染细胞比,PCDH-CRKL转染K562中CRKL表达增加116.3%（P=0.0004）,p-CRKL增加81.0%（P=0.0047）;p-Raf、P-MEK、p-ERK表达分别降低35.7%（P=0.0147）、40.7%（P=0.0039）、41.0%（P=0.0005）。这三组细胞中Raf、MEK、ERK、Ras的表达均无差异。10.PD98059抑制ERK通路后,与miR-NC mimic转染细胞比,miR-429 mimic转染K562细胞红系分化率上升67.0%（P=0.0032）;与miR-429 mimic转染细胞相比,miR-429 mimic+PD98059转染细胞红系分化率降低34.5%（P=0.0088）。与si-NC转染细胞相比,si-CRKL转染细胞红系分化率升高72.0%（P=0.0002）;与si-CRKL转染细胞相比,si-CRKL+PD98059转染细胞红系分化率降低55.5%（P=0.0002）。相应地,ERK通路阻断后,与miR-NC mimic转染细胞相比,miR-429 mimic转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别升高74.8%（P=0.0022）、43.5%（P=0.0020）、42.5%（P=0.0011）;与miR-429 mimic转染细胞相比,miR-429 mimic+PD98059转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别降低56.2%（P=0.0015）、63.6%（P=0.0022）、23.1%（P=0.0286）。与si-NC转染细胞相比,si-CRKL转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别升高24.2%（P<0.0001）、28.7%（P=0.0338）、48.5%（P=0.0164）;与si-CRKL转染细胞相比,si-CRKL+PD98059转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别降低46.0%（P=0.0052）、30.9%（P=0.0172）、44.5%（P=0.0059）。结论:1.在CML临床样本中miR-429低表达,CRKL高表达,二者负相关。2.miR-429促进K562细胞红系分化。3.CRKL抑制K562细胞红系分化。4.miR-429靶向CRKL通过激活ERK信号通路调控K562细胞红系分化。