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目的:本实验拟用SD大鼠构建整体心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤模型,探讨丹参酮ⅡA在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及机制;并利用H9c2细胞构建缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation,A/R)损伤模型,对AMPKɑ2蛋白介导丹参酮ⅡA心肌保护机制作进一步研究。方法:(1)取健康雄性SD大鼠50只(250-280g,7-8周),丹参酮ⅡA预处理组术前30 d连续灌胃丹参酮ⅡA磺酸钠注射液,15mg/kg/d;利用心肌内注射法转染AMPKα2-siRNA及空载阴性病毒;结扎冠状动脉左前降支法构建I/R损伤模型。实验分5组:(1)假手术组(Sham);(2)缺血/再灌注组(I/R);(3)丹参酮ⅡA+I/R(TanⅡA+I/R);(4)丹参酮ⅡA+阴性慢病毒载体+I/R组(Tan ⅡA+NC+I/R);(5)丹参酮ⅡA+AMPKα2-siRNA+I/R组(TanⅡA+AMPKα2-siRNA+I/R)。(2)利用Powerlab系统采集心脏心电信号了解各组大鼠建模情况;心肌组织做冰冻切片观察慢病毒转染程度;Western blotting检测丹参酮ⅡA及AMPKα2-siRNA对心肌组织AMPKα2蛋白表达水平的影响。(3)利用TTC染色法测量大鼠心肌梗死面积;TUNEL法检测组织细胞凋亡情况;分光光度计测定大鼠血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及乳酸脱氢酶(LDH)的活性,比较研究丹参酮ⅡA抗I/R损伤发挥保护心肌作用与AMPKα2蛋白的关系。(4)H9c2细胞转染AD-scrRNAi腺病毒,构建缺氧/复氧损伤模型,利用免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation,Co-IP)及免疫荧光双染色法检测AMPKα2与14-3-3η的相互作用及共定位情况,以探讨AMPKα2介导的丹参酮ⅡA发挥心肌保护作用的具体机制。结果:(1)大鼠体表心电图变化确定成功构建整体I/R损伤模型;慢病毒转染20天后,荧光显微镜观察心肌组织中有绿色荧光蛋白(Green Fluoreseent Protein,GFP)表达,提示心肌组织成功转染AMPKα2-siRNA慢病毒;且AMPKα2-siRNA#2组中AMPKα2蛋白干扰效果最明显。(2)Western blotting结果显示Tan ⅡA预处理组与I/R组相比,AMPKα2蛋白表达水平明显增高,而转染AMPKα2-siRNA慢病毒干扰AMPKα2表达后,Tan ⅡA上调AMPKα2蛋白表达作用被逆转。(3)与I/R组比较,Tan ⅡA+I/R组大鼠心肌梗死面积明显减少,细胞凋亡水平降低;而且血清中LDH活性明显下降、MDA的含量明显减少、SOD酶与GSH-Px酶活性明显升高,结果均具有统计学意义(p<0.01);而给予AMPKα2-siRNA干扰AMPKα2蛋白表达后,丹参酮ⅡA抗心肌I/R损伤作用被逆转,提示丹参酮ⅡA抗心肌I/R损伤作用与AMPKα2蛋白作用相关。(4)H9c2细胞经A/R后,Co-IP法显示AMPKα2与14-3-3η之间的相互作用增强;而用AD-scrRNAi干扰14-3-3η表达后,相互作用增强趋势被逆转,提示AMPKα2发挥活性作用与14-3-3η蛋白相关;激光共聚焦显示H9c2细胞在A/R后,AMPKα2蛋白核中表达增高;而在14-3-3η腺病毒AD-scr RNAi预处理后,14-3-3η蛋白表达降低,同时AMPKα2蛋白在核中的表达亦降低;提示心肌细胞发生A/R时,AMPKα2与14-3-3η会发生相互作用并共定位于细胞核而发挥保护作用。结论:1、丹参酮ⅡA磺酸钠预处理对大鼠心脏I/R损伤具有显著的保护作用。2、丹参酮ⅡA磺酸钠预处理对抗I/R损伤可能是通过上调AMPKα2/14-3-3η蛋白的相互作用实现的。