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细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),又称细菌内毒素(endotoxin, ET),是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的类脂多糖,广泛存在人和动物的消化道内。在肠道感染、饮酒等应激状态下,肠粘膜通透性增加,肠道LPS进入血液循环,引起血液LPS浓度迅速升高。动物实验研究已证实,妊娠早期接触LPS可产生显著的胚胎毒性,主要表现为胚胎吸收、流产和早产,但其作用机制目前尚不清楚。本课题在建立小鼠妊娠晚期接触低剂量LPS引起宫内胎儿死亡(IUFD)、生长发育迟缓(IUGR)和骨骼发育迟缓的动物模型基础上,进一步研究了活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用,并深入探讨了抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、抗坏血酸(AA)和褪黑素(MT)对LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的影响。1. LPS诱发IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓为研究LPS诱发IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的作用,LPS各剂量组孕鼠于妊娠第15-17天每天经腹腔注射一定剂量的LPS(25~75μg/kg, ip),对照组经腹腔注射等容量的生理盐水。妊娠第18天处死所有孕鼠,统计活胎、死胎和吸收胎数,称量活胎体重,测量胎鼠身长和尾长,并对胎鼠骨骼发育情况进行评价。结果显示:LPS各剂量组平均每窝死胎数显著高于对照组,并呈明显的剂量-效应关系。进一步观察发现,妊娠晚期接触LPS显著降低活胎平均体重、身长和尾长,并延缓胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化。上述研究结果表明:母鼠妊娠晚期接触低剂量LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。2. TNF-α在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用为探讨TNF-α在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用,LPS处理组孕鼠于妊娠晚期经腹腔注射LPS(75μg/kg, ip);LPS+PTX处理组孕鼠于注射LPS前0.5 h给予TNF-α的合成抑制剂己酮可可碱(PTX, 100 mg/kg, ip),对照组经腹腔注射等容量的生理盐水或PTX。部分孕鼠给药第1天处死,测母肝、胎肝和胎盘的TNF-αmRNA及羊水和母血清TNF-α水平等。部分孕鼠边续给药3天,于妊娠第18天处死,记录活胎、死胎和吸收胎数,称活胎体重,测量胎鼠身长和尾长,并评价胎鼠骨骼发育情况。结果显示:LPS显著诱导母肝和胎盘组织TNF-αmRNA表达,增加母鼠血清和羊水TNF-α浓度;PTX预处理显著抑制TNF-α产生。进一步研究发现:单纯LPS处理组平均每窝死胎数显著高于对照组,PTX预处理预防LPS引起的IUFD;单纯LPS处理显著降低活胎体重、身长、尾长,延缓胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化,PTX预处理明显减轻LPS引起的生长发育和骨骼发育迟缓。这些研究结果提示:TNF-α至少部分参与LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。3. ROS和NO在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用为探讨ROS和NO在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用,LPS处理组孕鼠于妊娠第15-17天每天注射LPS(75μg/kg, ip),LPS+PBN处理组孕鼠于注射LPS(75μg/kg, ip)前0.5 h和后3 h分别给予一定剂量的2-苯叔丁基硝酮(PBN, 100+50 mg/kg, ip);LPS+AG处理组孕鼠于注射LPS(75μg/kg, ip)前0.5 h和后3 h分别给予一定剂量的氨基胍(AG, 50+25 mg/kg, ip);对照组给予等容量的生理盐水或AG。部分孕鼠给药第1天处死,测母肝、胎肝和胎盘的MDA等。部分孕鼠边续给药3天,于妊娠第18天处死,记录活胎、死胎和吸收胎数,称量活胎体重,测量胎鼠身长和尾长,并对胎鼠骨骼发育情况进行评价。结果显示:AG处理对LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓几无影响,而PBN处理组平均每窝死胎数明显低于单纯LPS处理组,PBN处理显著减弱LPS降低胎鼠体重、身长和尾长,并显著抑制LPS引起枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌(趾)骨骨化不全。进一步研究发现,单纯LPS处理组与对照组比较,母鼠血清和羊水中NO水平无显著性差异(资料未列出);PBN显著对抗LPS引起的氧化应激,主要表现为:母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平下降且GSH含量上升。这些研究结果提示:ROS在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中可能发挥重要作用,NO在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用不明显。4. NAC、AA和MT对LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的影响NAC、AA和MT是重要的抗氧化剂,为探讨NAC、AA和MT对LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的影响,孕鼠被分成两个实验组:实验1,LPS处理组孕鼠于妊娠第15-17天每天经腹腔注射LPS(75μg/kg, ip);LPS+NAC组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射NAC;LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射AA;LPS+MT组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射MT,对照组给予等容量的生理盐水或NAC、AA和MT。所有孕鼠于妊娠第18天处死,统计活胎、死胎和吸收胎数,称量活胎体重,测量活胎身长和尾长,并评价胎鼠骨骼发育情况。实验2,LPS处理组孕鼠于妊娠第15天经腹腔注射单剂量的LPS(75μg/kg),LPS+NAC、LPS+AA和LPS+MT组孕鼠于LPS处理前和/或处理后经腹腔分别注射注射NAC、AA和MT,对照组给予等容量的生理盐水或NAC、AA和MT。孕鼠于LPS处理后1.5 h或6 h处死,检测母肝、胎肝和胎盘组织丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平,并测LPS+NAC组羊水和血清TNF-α含量。结果显示:LPS+NAC预处理组、LPS+AA预处理组、LPS+MT预+后处理组和后处理组宫内胎儿死亡数显著低于单纯LPS处理组;LPS+NAC后处理、LPS+AA后和预+后处理组平均每窝死胎数与单纯LPS组比较差异无显著性意义。此外,LPS+NAC预处理和后处理、LPS+AA各处理和LPS+MT各处理组均显著抑制LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓。进一步研究发现:NAC预处理显著抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化,NAC后处理显著抑制LPS引起母肝组织脂质过氧化,但对LPS引起的胎肝和胎盘组织脂质过氧化无明显抑制作用;NAC预处理显著抑制LPS引起血清和羊水TNF-α水平上升,而NAC后处理对LPS引起血清TNF-α水平上升无明显影响。AA预和后处理均显著抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化,但AA预处理的作用强于后处理。MT预+后处理显著抑制LPS引起母肝和胎盘组织脂质过氧化,MT后处理显著抑制LPS引起胎盘组织脂质过氧化;但MT预+后处理和后处理对LPS降低母肝组织GSH含量均无明显影响。上述研究结果提示:NAC预处理预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓,NAC后处理对LPS引起IUFD无明显影响,且加重LPS引起早产;AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激,预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓,AA后和预+后处理对抗LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓,但对LPS引起IUFD无保护作用;MT通过抑制LPS引起氧化应激,对抗LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。根据上述研究结果,本课题可得出如下结论:(1)母鼠妊娠晚期接触LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓;(2)TNF-α部分参与了LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓;(3)ROS在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中发挥重要作用;NO在LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓中的作用不明显;(4)NAC预处理预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓,NAC后处理对LPS引起IUFD无明显影响,且加重LPS引起早产;AA预处理预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓,AA后和预+后处理对抗LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓,但对LPS引起IUFD无保护作用;MT对LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓具有明显保护作用。