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目的胃癌（Gastric Cancer,GC）是最常见的恶性消化道肿瘤之一,其发病率和死亡率在世界范围内均很高。随着医疗技术的发展,胃癌在发达国家的发病趋势有一定的下降,但在我国,每年胃癌新发病例的增长仍逐年上升,且患者预后较差。早期胃癌发病隐匿,多数患者确诊时已处于晚期,且肿瘤细胞发生转移,严重影响治疗效果。因此,深入研究胃癌的发病机制,寻找新的早期诊断标志物和治疗靶点,对于提高胃癌患者的5年生存率和改善胃癌患者的生活质量具有十分重要的意义。胃癌的发生、发展、浸润和转移是一个涉及多基因表达失调的过程,原癌基因的激活和抑癌基因的失活是胃癌发生的始动原因之一。纤维连接蛋白1（fibronectin 1,FN1）是一种糖蛋白分子,广泛存在于平滑肌细胞层、血管细胞膜、神经细胞层等细胞结构中,参与了多种细胞的细胞粘附、迁移、细胞运动等过程。近年来发现,FN1在肺癌、结直肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中发挥了重要调控作用,但其在胃癌中的调控作用及机制尚少有报道,且存在一定的争议。因此,本研究旨在探讨纤维连接蛋白1（Fibronectin 1,FN1）在胃癌组织中的表达及临床意义,明确其对胃癌细胞生物学功能的调控作用,初步探讨FN1影响胃癌进展的作用机制。方法1、收集56例胃癌组织样本,采用RT-PCR及Western blot法、免疫组织化学（IHC）检测胃癌组织和癌旁正常组织样本中FN1 mRNA和蛋白表达,分析FN1表达与胃癌患者临床病理参数的相关性。收集患者预后信息,通过绘制Kaplan-Meier生存曲线分析FN1表达与胃癌患者总生存率和无病生存率的相关性,单因素和多因素回归分析影响胃癌患者生存的独立危险因子。2、采用RT-PCR和Western blot法检测4种胃癌细胞系和正常胃粘膜细胞中FN1 mRNA和蛋白表达水平,选取差异性表达程度最大的SGC-7901细胞和差异性表达程度最小的AGS细胞作为后续研究对象,通过细胞转染的方法建立稳定过表达和敲低FN1表达的胃癌细胞系。3、采用CCK-8法和平板克隆实验检测过表达和敲低FN1后各组胃癌细胞的增殖活性,并绘制生长曲线。流式细胞术检测各组胃癌细胞的细胞周期和凋亡情况,同时采用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。细胞划痕检测各组胃癌细胞的迁移距离,采用Transwell法检测FN1表达对胃癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响,Western blot法检测FN1表达对胃癌细胞上皮间质转化（EMT）过程中相关蛋白表达的影响及对RAS-MAPK信号通路相关分子表达的影响。4、通过在裸鼠左侧腋窝皮下注射胃癌细胞悬液的方式建立裸鼠移植瘤模型,用相对瘤体体积来表示肿瘤体积,并根据检测结果以天数为横坐标,移植瘤体积为纵坐标,绘制肿瘤生长曲线,4周后采用颈椎脱臼法处死裸鼠,获取肿瘤组织,比较各组移植瘤体积、重量,并采用Western blot法和免疫组化法检测肿瘤组织中FN1蛋白、增殖相关蛋白的表达和RAS-MAPK信号通路相关分子表达水平。结果1、RT-PCR结果显示,FN1 mRNA在胃癌组织中平均相对表达水平为（1.68±0.11）,显著高于癌旁正常组织的平均相对表达水平（1.01±0.03）（P＜0.05）。此外,胃癌组织FN1蛋白表达水平亦显著高于癌旁正常组织（P＜0.05）。免疫组化结果显示,FN1在胃癌组织中阳性表达率（60.7%）显著高于癌旁正常组织（16.1%）（P＜0.05）。相关性分析结果显示,FN1表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度、TNM分期和有无淋巴结转移显著相关（P＜0.05）,而与患者的性别、年龄、分化程度、肿瘤大小无显著相关性（P＞0.05）,表明FN1的表达影响胃癌患者肿瘤进展程度。预后分析结果显示,FN1低表达胃癌患者具有更长的总生存期和无病生存期,进一步多因素回归分析结果显示,FN1表达水平和浸润深度是胃癌患者预后的独立预测因素。2、RT-PCR和Western blot结果显示,FN1 mRNA和蛋白在4种胃癌细胞系（AGS、SGC-7901、MGC-803、BGC-823）中表达均显著高于人正常胃粘膜细胞（GES-1）,表明FN1在胃癌细胞系中过表达,与胃癌组织中的表达情况一致。经细胞转染后,可将过表达FN1的AGS细胞株分为空白对照NC-1组、阴性对照Vector组和FN1组,将敲低表达FN1的SGC-7901细胞株分为空白对照NC-2组、阴性对照siRNA-con组和 siRNA-FN1 组。3、CCK-8和平板克隆实验结果显示,在AGS细胞中,过表达FN1后胃癌细胞的增殖活性显著增强（P＜0.05）,而在SGC-7901细胞中敲低FN1表达后,胃癌细胞的增殖活性显著降低（P＜0.05）。流式细胞术结果显示,过表达FN1后AGS细胞的凋亡率显著降低（P＜0.05）,而敲低FN1表达后SGC-7901细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）。细胞周期检测结果显示,过表达FN1后,处于S期的AGS细胞比例显著升高（P＜0.05）,而敲低FN1表达后处于S期SGC-7901细胞比例显著下降（P＜0.05）。细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,过表达FN1可显著增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。Western blot结果显示,过表达FN1,胃癌细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）,而E-cadherin和γ-catenin表达水平显著降低（P＜0.05）;而敲低FN1表达后则观察到相反的结果,表明FN1可促进胃癌的EMT过程。4、为了初步探讨FN1影响胃癌细胞的作用机制,我们采用Western blot检测胃癌细胞中RAS-MAPK信号通路相关分子表达水平。结果显示,过表达FN1后,胃癌细胞AGS中Ras、Raf和ERK1/2蛋白的表达显著升高（P＜0.05）,表明FN1可激活胃癌细胞RAS-MAPK信号通路。5、通过皮下注射的方式成功建立裸鼠皮下移植瘤,根据测量的移植瘤体积数据,计算移植瘤相对体积和平均重量,我们发现敲低表达FN1的SGC-7901细胞株中siRNA-FN1组细胞移植瘤的平均体积显著小于siRNA-con组（P＜0.05）。移植瘤裸鼠从第6天开始出现肉眼可见的瘤体,肿瘤生长曲线结果显示,从第15天开始,siRNA-FN1组移植瘤的生长明显减慢,其瘤体积与siRNA-con组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。表明敲低FN1表达可抑制胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤的体积和重量。6、Western blot检测结果显示,敲低FN1表达后,移植瘤中Bcl-2和survivin蛋白的表达显著降低（P＜0.05）,且siRNA-FN1组中Ras、Raf和ERK1/2表达水平显著低于siRNA-con组和NC-2组,差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论FN1在胃癌中表达上调,其表达水平与胃癌患者的肿瘤浸润深度、TNM分期及有无淋巴结转移显著相关,FN1可作为胃癌预后判断的独立危险因素。FN1可促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力和EMT过程,并抑制其凋亡,其机制与靶向作用RAS-MAPK信号通路有关。