spo0A基因突变对解淀粉芽孢杆菌PEBA20生物膜和抑菌活性的影响

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本研究主要对植物内生生防细菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)PEBA20菌株的spo0A基因进行了检测,spo0A基因不仅对细菌生物膜形成具有调控作用,而且是芽孢形成的主要调控基因,更进一步的协调了细菌抑菌活性、运动性等多种细胞进程。利用同源重组法构建了spo0A基因缺失突变株,进而验证了该基因对解淀粉芽孢杆菌PEBA20菌株运动性、生物膜形成、抑菌活性和芽孢形成的影响。  本文主要研究结果如下:  1、对B.amyloliquefaciens PEBA20野生株、多株自然突变株和人工突变株的簇动性进行检测,结果表明,解淀粉芽孢杆菌的簇动表型具有多样性,而基因的突变会影响簇动表型的变化。  2、将实验室已经获得的spo0A同源前臂和同源后臂的连接质粒spo0AF-spo0AB(于占翠2012年)与自杀质粒pWM91经酶切、T4连接酶连接得到重组质粒spo0AF-spo0AB-pWM91。将构建得到的重组质粒经电转化方法转化入B.amyloliquefaciens PEBA20感受态细胞中,采用氨苄和蔗糖两步筛选法获得spo0A基因缺失的PEBA20突变株。以缺失株DNA为模板进行PCR筛选阳性克隆,并通过测序进一步确定获得spo0A基因缺失突变株△spo0A。  3、检测B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和△spo0A菌株的运动性差异。结果表明,突变株与野生株相比,依赖鞭毛的簇动能力减弱,但是簇动表型分化较野生株复杂;依赖菌毛的推动性结果显示突变株扩散范围较大,但是粘附力与野生株相比要较弱。  4、对B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和△spo0A菌株在固气界面生物膜动态形成特点进行检测。结果表明,野生株与突变株均有形成生物膜的能力,但是与野生株相比,△spo0A菌株复杂程度退化,生物膜结构相对简单,褶皱不明显。静置培养条件下,检测气液界面生物膜动态形成过程。结果表明,在气液界面野生株具有形成复杂褶皱结构生物膜的能力,而△spo0A菌株不具备形成生物膜的能力。因此,spo0A基因缺失突变可导致生物膜形成功能退化以致于丧失。  5、对B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和△spo0A菌株的菌体芽孢形态检测结果显示,spo0A基因缺失突变导致菌株完全丧失了产孢能力,且突变株的菌体与野生株相比较为短小。  6、检测B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和△spo0A菌株对四种真菌和三种细菌的抑菌活性。结果显示,与野生株相比,△spo0A菌株对四种指示真菌和三种指示细菌抑菌效果均下降,并且对其中某些真菌和细菌的差异显著水平较为显著。这表明spo0A基因的缺失突变影响了生防细菌对指示真菌和指示细菌的抑菌活性作用。
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