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蛋白质在生物活动过程中具有很多重要功能,蛋白质与小分子相互作用的研究已经成为化学、生命科学、临床医学等领域关注的热门课题之一。本课题采用流动注射化学发光法(Flow Injection Chemiluminescence,FI-CL),以鲁米诺(luminol)为化学发光探针,首先建立了鲁米诺-模型蛋白体系,以此为基础探讨了溶菌酶-镧系离子的相互作用,肌红蛋白-邻苯二甲酸二丁酯的相互作用,并对其分析应用做了进一步的研究。本论文内容包括如下两个部分:第一部分综述第一章绪论蛋白质与小分子的相互作用已经成为化学、生命科学、临床医学等领域关注的热门课题之一。通过它们之间的研究可以从蛋白质与小分子的结合常数,结合位点数,结合部位,对蛋白质的构象变化等很多方面进行分析,从而有助于在各个角度层面阐述蛋白质与小分子的作用机理与规律,对于蛋白质与小分子的作用研究具有更加现实的意义。常用的研究方法有:荧光光谱法、紫外可见吸收光谱法、圆二色谱法、核磁共振法、分子对接法以及流动注射化学发光法等。常用的模型蛋白有溶菌酶(Lysozyme,Lys)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、肌红蛋白(Myoglobin,Mb)和过氧化氢酶(Catalase,Cat)。第二部分研究报告第二章Luminol-Protein体系建立及相互作用研究本章基于protein可以增强luminol的化学发光强度,化学发光强度(△I)与蛋白浓度(Cp)具有良好的线性关系,建立了 Luminol-Protein体系。以luminol为探针,首次采用FI-CL研究了四种模型蛋白BSA、Mb、Lys和Cat与luminol之间的相互作用。并建立了 protein 与 luminol 相互作用的 FI-CL 模型,lg[(Io-I)/I]= l/nlg[P]+ l/nlgKa + 2lgn,得到其288、298和308 K下的结合常数Ka与结合位点数n,结合常数Ka在105-107L mol-1数量级之间,protein与luminol之间的亲和能力遵从大小顺序:Cat>Mb>Lys>BSA,而luminol与BSA和Lys的n约等于2,与Mb和Cat的n约等于1。依据Van’t Hoff方程,计算出热力学参数(△H、△,S和△G),从而推断出protein与luminol之间主要是自发的疏水作用力。随后采用分子对接的方法从蛋白分子结构与最佳构象方面进行研究,对接结果发现,BSA,Lys,Mb,Cat与luminol主要以疏水作用力为主,氢键为铺,并得到AG与结合常数K,对照两种方法的结果一致,说明FI-CL可用分子对接法作为辅助技术,用于分析protein与luminol相互作用的结合位点和结合类型。本研究工作发表在ISRN AnalyticalChemistry,2013,2013,1-5(第一作者)。第三章Lysozyme与Lanthanide ions相互作用研究在本实验中,以luminol为发光探针,基于镧系离子(Lanthanide ions,LnⅢ)会猝灭Luminol-Lysozyme体系的化学发光强度,△I与CLn的对数之间呈现良好的线性关系,建立了线性方程△I=AlnCLn+B(A,B定义为灵敏度因子和作用因子)。根据FI-CL模型,lg[(Io-I)/I]= + nlg[Ln]+lgK,计算得出Lys与LnⅢ相互作用的结合常数(K= 105-106 Lmol-1数量级),结合位点数(n=1.0),得到相关的热力学参数,分析表明Lys与LnⅢ之间相互作用为自发的静电作用。探讨了灵敏度因子A与原子序数Z以及其他的一些物理参数(离子半径γ±,水合焓△Hyd和标准氧化还原电位E0)之间的关系,结果发现LnⅢ的A与它自身的电子构型[Xe]4fn有关,A随着Z的增大而增大,轻镧系(LL)与重镧系(HL)在Gd(f7)处有断带,说明其遵从镧系收缩和钆断效应。最后探讨了其可能的作用机理。本研究工作发表在SCI源期刊RSC Advance,2014,4(36),18694-18701(第一作者)。第四章Myoglobin与Dibutyl phthalate相互作用研究在本实验中,我们发现邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)能够猝灭Luminol-Myoglobin体系的化学发光强度,而且发光强度的减小值(△I)与DBP的浓度(CDBP)的对数值在0.1-100 pg mL-1范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.03 pg mL-1,RSDs<3.5%。当溶液流速2.0mLmin-1时完成一次分析测定过程仅需30 s。测定DBP的回收率为96.0-103.3%且RSD小于3.0%(n = 5)。本方法简便快速并成功用于检测白酒实际样品,并用GC-MS做了对照实验,结果良好,还测定了人体血清和尿样中的DBP含量。运用FI-CL模型计算出Mb与DBP相互作用的结合常数(K=1.55 × 104 L mol-1)和结合位点数(n= 0.86),以紫外可见吸收光谱法和分子对接法为辅,说明Mb与DBP生成了 1:1的复合物,从而引起了 Mb构型的变化,导致其化学发光强度猝灭。本研究工作发表在 SCI 源期刊Journal of Food Compositionand Analysis,2013,31,226-231(第一作者)。第五章Luminol-Lysozyme体系测定LaⅢ含量本实验基于LaⅢ能够猝灭Luminol-Lysozyme体系的化学发光强度,而且发光强度的变化值△I与CLa的浓度的对数值在0.1-50.0 nmol L-1范围内呈现良好的线性,检出限为0.03 nmol L-1,RSDs<3.0%。另外,我们还成功的检测出镧的络合物样品中La111的含量,样品的RSD<2.0%,并以同样的样品做了 ICP-AES对照实验,结果良好。