基于核酸的快速检测技术在阿胶掺假和致病菌检测上的应用

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近年来,随着经济的迅猛发展,食品安全问题浮出水面,如高值食品掺假问题,养殖动物药残超标问题等。作为食品安全监管的重要技术手段,检测技术的不断创新与进步是有效监管的重要保障。食品安全检测技术分为“确认检测技术”和“快速检测技术”两大类。“确认检测技术”精准、可靠,但是时效性差、检测时间长、成本高、需要专用的检测仪器以及专业的操作人员。“快速检测技术”作为筛查及现场执法支撑技术,如化学比色分析技术、生物传感器技术、生物芯片技术等,在保证检测结果准确性的基础上缩短了检测时间,摒弃了各类检测仪器与设备,简化了操作流程,降低了检测成本,尤其是不受环境的制约,任何操作人员可以在任何时间、任何地点应用快速检测的相关技术开展检测工作,在很大程度上提高了食品安全监管相关工作的效率。本文研究围绕基于核酸检测的生物快速检测技术展开研究和实践。建立了基于单拷贝基因的阿胶掺假PCR定量检测方法。开发了基于重组酶聚合酶等温扩增技术的鸡白痢沙门氏菌快速鉴定核酸侧流层析试纸条。主要内容如下:(1)阿胶因其较高的营养价值,特别是药用价值而受到人们的高度重视。但由于其产量低、价格高,市场上掺假现象频发。为了定量检测掺假阿胶中的驴皮含量,本研究利用拷贝数及表达量一致的保守基因序列的单拷贝核基因作为内参引物,建立实时荧光定量PCR方法。以猪皮与驴皮指定含量的混合物为模拟样品,以Ct值(特异性/参比)为基准,建立标准曲线,线性范围为5%-100%。对实际样品的检测,结果表明所提出的该荧光定量PCR方法可以从混合动物产品中特异性地鉴定出驴皮成分,并量化阿胶的含量。该方法快速、简便,对掺入猪皮的驴皮具有较高的特异性和敏感性,灵敏度可达5%。为追求经济利益而故意掺假的情况一般在5%以上,故该方法有助于从经济角度进行阿胶掺假检测。(2)鸡白痢是威胁家禽业的细菌性疾病,已被列为政府要消灭的细菌性疾病。传统的沙门氏菌血清分型检测方法成本高、劳动强度大。常用的平板凝集试验方法往往会对雏鸡造成物理伤害。因此,一种快速、无损伤的检测方法对早期诊断具有重要意义,是精准用药、消除白痢的关键步骤。在本研究中,我们提出一种基于核酸的侧流层析试纸条系统,结合重组酶聚合酶扩增反应来检测鸡白痢沙门氏菌。核酸侧流层析试纸条系统,利用spacer C3-ssDNA修饰的反向RPA引物在RPA扩增后,可以与带有其互补DNA链的金纳米颗粒结合,而以生物素标记的正向引物与链霉亲和素结合,在检测线上进行显色。控制线上修饰可与金标探针的碱基链互补结合的单链DNA,捕获金标探针,在控制线显色。该方法具有快速、灵敏、肉眼可见等优点。我们采用琼脂糖凝胶电泳方法和传统的血清分型试验评价了该系统的灵敏性和特异性。结果证明,该系统对鸡白痢沙门氏菌的基因组DNA检测限为5×10-3 ng/μL,灵敏度较高。在实际检测中,该系统具有成本低、效率高、对雏鸡无害的特点,为鸡白痢的早期诊断提供了技术支持,为精准用药提供了便捷的评估手段。此外,依托国家重点研发计划-政府间国际科技创新合作重点专项,总结了国际合作项目的管理上的突破与创新。项目开创了科研团队混编的创新合作方式,执行扁平化管理,并进行了全方位多角度的宣传,在耐药性和动物福利科研方向上致力于从“小学术圈”的影响力延伸到“大学术圈”。这些新颖的方法和理念可以为后续国际合作项目的管理和实施提供借鉴。
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