冠心病以局部心肌组织缺血、部分心肌细胞坏死和坏死区疤痕形成为主要特征。其治疗应包括改善局部血液循环、修复坏死心肌和减少局部疤痕形成三个方面。肝细胞生长因子（HGF）具有很强的促血管生长和抗纤维化作用，而骨髓间充质干细胞（MSC）可以分化成心肌细胞，为此我们开展了MSC联合HGF治疗心肌缺血及其相关机理的研究。目的是评价HGF基因修饰MSC治疗缺血性心脏病的可行性及其疗效，为基因修饰干细胞治疗损伤性疾病提供实验基础；并探讨HGF诱导血管生长的机理，包括对骨髓干细胞的动员作用、对内皮细胞的生物学作用及其分子调控，为HGF基因修饰干细胞治疗缺血性疾病提供理论基础。 利用Percoll密度梯度分离方法和MSC贴壁生长的特性，我们分离纯化了人及大鼠的骨髓MSC。免疫组化染色结果表明，这些细胞表达HGF的受体c-Met。在此基础上，我们观察了重组HGF因子对MSC增殖、分化、迁移等功能的影响。结果发现，HGF刺激MSC增殖的作用不明显，也不影响MSC向肌细胞和成骨细胞的分化，但可明显诱导MSC的迁移，并能抑制anoikis诱导的MSC死亡。随后，我们分别用携带GFP和HGF基因的腺病毒载体（Ad-GFP和Ad-HGF）感染MSC，用流式对感染率进行测定，用ELISA方法检测HGF的分泌表达。流式测定结果表明，随着感染强度的加大，腺病毒感染MSC的效率也明显增高。在感染强度MOI=150时，感染率就几乎达到了100％。ELISA分析结果表明，在感染后HGF有短期（2W左右）和高效的表达（最高达128ng／mL）。通过结扎冠状动脉左前降支（LAD），我们建立了雌性大鼠的急性心肌缺血模型，将高表达HGF基因的雄性MSC注射到心肌缺血的局部。4W后分析大鼠的心肌缺血区面积大小、局部胶原沉积、心功能变化等多项指标。血液动力学测定结果表明，治疗组大鼠的心功能得到了明显改善。表现在反映心脏收缩功能的左心室收缩压（LVSP）和左心室内压最大上升速率(dP／dt_max)与模型组相比明显增加，而反映心脏舒张功能的左室舒张末压（LVEDP）则明显降低。组织病理学检查发现，治疗组心脏的缺血区面积明显缩小，新生血管明显增多，胶原沉积显著降低。进一步性别决定基因Sry原位杂交结果表明，局部注射的雄性大鼠来源的MSC部分整合到了雌性大鼠心肌缺血的局部，形态与周围心肌细胞难以区分。 在上述实验的基础上，我们对HGF促进血管生长和抑制疤痕形成的细胞和分中文摘要子机理进行了探索研究。 首先，考虑到HGF对细胞的扩散作用（HGF又称扩散因子）和骨髓干细胞在血管生长中的重要作用，我们观察了HGF对骨髓干细胞的动员作用及动员细胞在组织修复及血管新生中的角色。将Ad一HGF经尾静脉注射到大鼠或小鼠的体内，然后于不同时间检测血浆HGF的水平和外周血中干细胞的含量变化情况。结果表明，尾静脉注射Ad一HGF后，大鼠和小鼠血浆的HGF水平均显著升高。同时外周血中的干细胞，表现在CD34+、UEA阳性细胞、造血集落形成细胞的数量明显增多。对外周血进行直接培养，发现注射Ad一HGF组的贴壁生长细胞数量也明显增多。进一步分析显示，这些贴壁细胞表达Tie一2、nk一1、c一Met和VIII因子相关抗原等内皮细胞的表面标志。这些结果表明，HGF能够动员骨髓中包括内皮祖细胞在内的多种干/祖细胞。为了证实这些动员的干/祖细胞是否参与了组织损伤修复时的血管新生，我们建立了小鼠的肝CC14损伤模型和大鼠的心肌缺血模型。将动员后的细胞经尾静脉移植到组织损伤的动物体内，Sry原位杂交结果表明，动员的干细胞参与了组织损伤时的血管再生。 其次，我们分析了HGF对人ECV304脐静脉内皮细胞系增殖、迁移、管状化结构形成的影响，并对其分子调控进行了探索研究。研究结果表明:HGF能明显诱导内皮细胞的迁移，但刺激细胞增殖和诱导细胞管状化结构形成的作用不明显;HGF激活内皮细胞 ERKI/2和PI3K信号通路，并通过MAPK和PI3K通路进一步活化鞘氨醇激酶（SPK），提高细胞内1一磷酸鞘氨醇（SIP）水平;SPK阻断剂DMS或负显性SPK基因转染均完全阻断了HGF诱导的内皮细胞迁移，而野生型SPK转染明显促进HGF诱导的细胞迁移:HGF通过SPK诱导促血管活性分子Cyr61的表达。 通过以上结果，我们可以得出:①HGF基因修饰MSC治疗心肌缺血既可以促进缺血区血管新生，降低局部胶原沉积，显著改善心功能，同时MSC本身能够分化为心肌样细胞，修复坏死的心肌，因此是治疗冠心病的一种新的、行之有效的方法;②HGF对骨髓干细胞具有明显的动员作用。动员骨髓干细胞可能是HGF促进血管生长、组织器官修复和肿瘤侵袭等的主要作用机制之一;③SPK激酶在调节HGF诱导的内皮细胞迁移中起着关键作用;④Cyr61可能通过旁分泌机制增强HGF的促血管生长和抑制疤痕形成作用。