前列腺癌是男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤。2020年,前列腺癌全球新发病例数为141万,占癌症新发病例总数的7.3%;死亡病例数为37万,死亡率占男性恶性肿瘤的第二位。虽然我国前列腺癌的发病率低于欧美国家,但随着我国经济发展带来的人口老龄化、肥胖、以及前列腺特异性抗原（prostate specific antigen.PSA）筛查的逐步推广应用,前列腺癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势,年增长率达8.92%,年死亡率达13.37%。因此,前列腺癌的精准诊断和治疗是不容忽视的重大医学问题。目前,雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy,ADT）是进展期前列腺癌（advanced prostate cancer）的首选治疗方案,但在治疗14-30个月后,几乎所有患者最终转变为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistantprostate cancer,CRPC）,预后较差。雄激素受体（androgenreceptor,AR）信号通路的异常激活在CRPC的发生和发展过程中发挥重要作用。我们和其他课题组的多项研究结果表明,CRPC的发生机制包括AR依赖型和AR非依赖型两种方式。其中AR依赖型机制发挥着重要的作用,主要包括AR基因的扩增和/突变、剪接变异体的产生、共调节因子的异常、内源性雄激素的合成、AR翻译后修饰的异常表达、致癌信号通路的异常激活等。由于CRPC发生发展的分子机制较为复杂,因此有效识别和靶向促进CRPC进展的关键癌基因和相关信号通路,深入探讨其在CRPC中的生物学表型和作用机制,对于确立克服CRPC的干预策略具有重要意义。PKMYT1（membrane-associated tyrosine and threonine-specific cdc2-inhibitory kinase,PKMYT1）是WEE激酶家族成员之一,通过膜系链定位于内质网和高尔基复合体中,少部分定位在核浆和核仁中。PKMYT1在调控细胞周期、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、DNA损伤修复、细胞信号转导等过程中发挥重要作用。近年来研究发现,PKMYT1在胃癌、食管癌、肺癌、直肠癌、卵巢癌和肝癌等多种肿瘤组织中高表达。PKMYT1可通过靶向调控CCNB1/CCNE1的蛋白表达,促进前列腺癌的恶性进展。我们课题组研究发现PKMYT1在CRPC临床组织样本和细胞系中表达显著增高,并通过促进AR入核进而激活AR信号通路促进CRPC的进展。本研究中,我们系统分析了 PKMYT1在CRPC进展中的生物学作用及分子调控机制,为探讨CRPC的发生发展新机制和靶向治疗提供重要思路和理论依据。第一部分:PKMYT1在CRPC中高表达并促进CRPC的发生和进展前列腺癌具有高度雄激素敏感性。雄激素通过激活AR信号通路促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和浸润、抗凋亡等。虽然ADT治疗使体内雄激素水平迅速下降,但可导致AR以及AR所介导的信号通路异常激活。此外,许多文献报道,除AR信号通路外,某些癌基因的过度表达和相关信号通路的异常活化在CRPC的发生和发展过程中,发挥了非常重要的作用。PKMYT1是一个重要的癌基因,在多种实体肿瘤,如胃癌、卵巢癌和食管癌中,促进肿瘤细胞的增殖、迁移和浸润、调控肿瘤细胞的周期分布并抑制其凋亡。我们在本部分的研究中以前列腺癌临床组织标本和前列腺癌细胞系作为研究对象,分别在临床组织样本和细胞水平上分析了 PKMYT1的表达及生物学作用,并取得如下研究结果:1.PKMYT1在CRPC组织中高表达,并与前列腺癌患者生存预后、肿瘤生化复发及恶性程度相关:我们首先使用GEO数据库分析了 PKMYT1在良性前列腺增生、局限性前列腺癌和CRPC三种临床组织样本中mRNA的表达情况。与良性前列腺增生和局限性前列腺癌组织样本相比,PKMYT1 mRNA的表达水平在CRPC组织样本中明显增高。接着,我们又收集了山东大学齐鲁医院病理科存档的2013-2018年30例局限性前列腺癌和24例CRPC的临床组织样本,进行免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色,结果显示:与局限性前列腺癌组织样本相比,PKMYT1在CRPC组织样本中高表达病例占比水平明显较高。最后,我们使用TCGA数据库分析显示:PKMYT1 mRNA的表达水平与患者生存预后及生化复发密切相关。PKMYT1高表达的患者具有较低的生存率和较高的生化复发风险。此外,PKMYT1的高表达与高Gleason评分、淋巴结转移、高临床分期和病理分期均呈正相关。2.PKMYT1促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和浸润:我们首先使用Western blot检测了 PKMYT1在前列腺癌细胞系中的蛋白表达量,选取了 PKMYT1表达最高的雄激素抵抗性C42B细胞与雄激素非依赖性22RV1细胞进行Si-RNA敲低;选取PKMYT1表达最低的雄激素敏感性LNCaP细胞进行过表达,并行后续细胞功能学及分子生物学实验。MTS和EdU用于检测胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和活性炭处理胎牛血清（charcoal stripped fetal bovine serum,CSS）两种培养状态下 PKMYT1 对细胞增殖效率的影响。结果显示:在FBS和CSS两种培养状态下,敲低PKMYT1的表达后可以抑制22RV1和C42B的细胞增殖,过表达PKMYT1后可以促进LNCaP细胞的增殖。我们使用Transwell实验检测PKMYT1对前列腺癌细胞迁移和浸润能力影响,结果显示:与对照组相比,敲低PKMYT1的表达后,FBS和CSS两种培养状态下22RV1和C42B细胞的迁移和浸润能力均明显减弱;过表达PKMYT1后,FBS和CSS两种培养状态下LNCaP细胞的迁移和浸润能力均明显增强。3.PKMYT1调控前列腺癌细胞的周期分布并抑制其凋亡:为了研究PKMYT1对前列腺癌细胞周期分布的变化及凋亡的影响,我们通过流式细胞术进行检测。结果分析显示:在细胞周期实验中,与对照组相比,敲低PKMYT1的表达后,肿瘤细胞中有丝分裂期的G0/G1期占比增高、G2/M期占比降低;在细胞凋亡实验中,与对照组相比,敲低PKMYT1的表达后,促进肿瘤细胞的凋亡。综上所述,本研究在临床组织样本和细胞系两种水平上,证实了 PKMYT1在CRPC中高表达;同时PKMYT1在FBS和CSS两种培养状态下均能够促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和浸润。此外,PKMYT1也可调控前列腺癌细胞的周期分布并抑制其凋亡。第二部分:PKMYT1通过激活AR信号通路促进CRPC进展的研究CRPC是前列腺癌进展的终末阶段。AR信号通路的异常激活在CRPC的进展过程中发挥着至关重要的作用。值得关注的是,已有报道显示,AR的翻译后修饰,尤其是磷酸化水平修饰可以调控AR的亚细胞定位以及下游靶基因的转录水平。有文献报道,PKMYT1在肿瘤的进展中可以激活多种致癌信号通路,包括MAPK、Notch和AKT/mTOR信号通路等。我们通过对前列腺癌细胞测序数据分析发现,PKMYT1的表达水平与AR及MAPK信号通路具有显著相关性。Shida等研究提示,MAPK信号通路中关键蛋白的磷酸化状态可使AR对二氢睾酮的敏感性增强,促进AR入核并发挥转录调控作用。本研究以前列腺癌细胞系为研究对象,系统探讨了 PKMYT1促进CRPC进展的分子作用机制,并取得了如下研究结果:1.PKMYT1是雄激素反应性基因:我们使用LNCaP细胞,研究了 PKMYT1在CSS状态下表达水平的变化。qRT-PCR和Westernblot结果显示:与FBS状态相比,在CSS状态下,PKMYT1 mRNA和蛋白的表达水平在LNCaP细胞中均明显升高,并具有时间依赖性。接着,我们使用在CSS状态下培养3d的LNCaP细胞,给予雄激素处理并设置不同的时间点和浓度梯度。qRT-PCR和Western blot结果显示:随着雄激素处理时间的延长和剂量的增加,PKMYT1在mRNA以及蛋白层面的表达水平均逐渐降低并成时间和剂量依赖性。最后,我们使用C42B细胞,在加入雄激素后给予AR的拮抗剂恩杂鲁胺（enzalutamide,ENZ）处理,qRT-PCR和Western blot结果显示:在加入雄激素后,PKMYT1的mRNA以及蛋白表达水平明显下降;加入雄激素联合ENZ处理后,PKMYT1的mRNA以及蛋白表达水平的下降得到部分逆转和恢复。2.PKMYT1是AR抑制性基因:GEPIA数据库分析显示,PKMYT1和AR呈负相关。qRT-PCR和Western blot结果显示:在C42B和LNCaP细胞中敲低AR的表达后,PKMYT1在mRNA和蛋白水平的表达均升高;在AR阴性的DU145细胞中过表达AR后,PKMYT1在mRNA和蛋白水平的表达均降低。因此,我们推测AR作为转录调控因子,可能结合到PKMYT1的启动子区上发挥调节作用。通过JSPAR网站预测分析,我们在PKMYT1的启动子区筛选了 4个可能的AR结合位点,并使用ChIP实验检测AR是否与PKMYT1的启动子区结合。数据表明:AR可以结合到PKMYT1的启动子区并对其发挥抑制作用;与CSS状态相比,在雄激素处理的LNCaP细胞中,AR在PKMYT1的启动子区富集程度更高。3.PKMYT1促进AR下游靶基因的转录:基于第一部分的研究内容,我们猜测AR及AR信号通路可能参与PKMYT1促进CRPC的发生和发展。因此,我们将22RV1 NC和22RV1 Si-PKMYT1细胞提取RNA并行RNA-seq测序。我们筛选差异基因（fold change＞1.5、p＜0.05）后,使用GSEA预测软件进行分析,发现雄激素诱导的基因集显著富集在22RV1 NC这一侧上（p＜0.01）。qRT-PCR结果显示:在C42B细胞中敲低PKMYT1的表达后抑制AR下游靶基因的转录,在LNCaP细胞中过表达PKMYT1后促进AR下游靶基因的转录。但qRT-PCR和Western blot结果显示:在C42B和LNCaP细胞中敲低或过表达PKMYT1后,AR的mRNA和蛋白表达水平均未发生明显变化。4.PKMYT1通过介导AR磷酸化后促进其入核:我们使用核质分离实验,分析了PKMYT1蛋白表达水平的变化对AR亚细胞定位的影响。Western blot检测结果显示:在C42B细胞中敲低PKMYT1的表达后,FBS和CSS两种培养状态下均可抑制AR入核;在LNCaP细胞中过表达PKMYT1后均可促进AR入核。Co-IP实验检测PKMYT1蛋白是否与AR蛋白有结合。Western blot检测结果表明:在LNCaP和C42B细胞中,PKMYT1并不与AR发生结合。已知PKMYT1具有丝氨酸/苏氨酸激酶调控作用。Western blot结果显示:在C42B细胞中敲低PKMYT1的表达后,AR第81位丝氨酸磷酸化（AR-S81）的蛋白表达水平降低;在LNCaP细胞中过表达PKMYT1后,AR-S81的蛋白表达水平升高。文献报道显示,在前列腺癌中,PP2A磷酸酶中的催化“C”亚基PP2Ac可以直接与AR-S81结合后使其去磷酸化;p-PP2Ac-Tyr307蛋白表达水平与PP2A磷酸酶的活性呈负相关。那么PKMYT1是否通过影响PP2A磷酸酶的活性进而调控AR-S81的蛋白表达水平呢?Western blot检测结果显示:在C42B细胞中敲低PKMYT1的表达后,PP2Ac蛋白的表达水平并未发生变化,但p-PP2Ac-Tyr307蛋白表达水平明显下降,从而使PP2A磷酸酶活性升高并降低AR-S81的蛋白表达水平。5.PKMYT1促进MAPK信号通路的激活:依据本部分“3”中的RNA-seq测序数据和同等条件下筛选的差异基因（fold change＞1.5、p＜0.05）,我们通过使用GESA预测软件发现了K-Ras诱导的基因集显著富集在22RV1 NC这一侧上（p＜0.0001）;MAP2K1诱导的基因集也明显富集在22RV1 NC这一侧上（p＜0.05）;还通过使用GSEA预测软件对RNA-seq测序筛选的差异基因（fold change＞1.5、p＜0.05）做GO功能富集分析,结果显示有差异基因显著富集在MAPK信号通路上。以上数据提示,PKMYT1可能调控MAPK信号通路。Western blot检测结果表明:在22RV1细胞中敲低PKMYT1的表达后,MAPK信号通路的关键蛋白MEK、ERK的磷酸化水平降低。综上所述,PKMYT1通过抑制PP2A磷酸酶活性进而使AR磷酸化水平升高并促进AR入核,促进CRPC发生和发展;PKMYT1介导调控的MAPK信号通路的异常激活,在CRPC的进展过程中亦发挥重要作用。