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植物形态发生的基因表达调控机制是组织与细胞培养的关键基础和研究热点。大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana Hamet&Perrier)的无性繁殖过程与植物组织培养阶段极其类似,即不定芽发生、不定根形成,小植株驯化等。解析其小植株发生的分子调控机制,对揭示农林作物植株再生的机制有启示,为细胞工程育种和育苗体系的提升提供原理和技术基础。以往的研究发现,大叶落地生根在适当干旱条件下叶齿隙容易发生不定芽,转录因子 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO I(KdSOC1)表达下调及功能朱知基因KdN41表达上调,这暗示了两种基因与大叶落地生根植株再生的调控相关。本研究以转基因、激光共聚焦显微观察等手段从3个方面对其进行深入研究和揭示。(1)将KdSOC1转入拟南芥SOC1功能缺失的突变体(soc1-2)、烟草和大叶落地生根鉴定其调控开花和不定芽发育的功能;(2)将KdSOC1启动子-GUS、35S-KdSOC1载体分别转化烟草和大叶落地生根、IAA介导表达的拟南芥植株(DR5启动子-GUS拟南芥)探究KdSOC1表达部位及其与生长素响应的关系;(3)KdN41功能鉴定则以干旱条件下KdN41启动子驱动GUS表达、黄色荧光蛋白YFP融合KdN41定位解析其在烟草组织与细胞中的分布;以KdN41转化烟草鉴定其调控开花的功能。结果表明,KdSOC1调控开花和IAA响应有关的不定芽发生;KdN41响应干旱信号在叶脉表达调控植株开花。主要研究结果如下:1.KdSOC1基因类似AtSOC1调控植株开花,也调控叶齿隙不定芽发生。KdSOC1具有AtSOC1基因类似的促进植物提早开花的功能。含有SOC1的野生型拟南芥在长日照条件下培养33±2 d开花;SOC1功能缺失的突变体soc1-2培养78± 3.1 d开花,转入KdSOC1基因的soc1-2成花时间为40±2.1 d,较前者早开花38 d。含SOC1的野生型烟草在长日照或短日照条件下成花时间分别为179±3.5 d和250±2.6 d,转KdSOC1烟草则分别为128 ± 3.6 d和192±1.5 d,两种转化植株的表型均表明KdSOC1正调控了植株开花。研究发现KdSOC1调控大叶落地生根叶齿隙不定芽的形成。转KdSOC1基因及其RNAi干扰的大叶落地生根叶盘均可诱导形成愈伤组织并从中再生不定芽。但转RNAi叶盘愈伤组织形成的不定芽发黄并枯萎未获得转基因植株;转KdSCO1基因叶盘愈伤组织再生的不定芽则生长发育,所形成的植株叶片叶齿隙产生不定芽5.3个(P<0.05),在叶缘两侧呈不对称分布;野生型植株叶齿隙则产生不定芽19个,且在叶缘两侧呈对称分布。转空载植株叶齿隙形成不定芽18个也在叶缘两侧对称分布。2.转KdSOC1烟草芽尖分生组织中与开花相关的LEAFY等4个基因上调表达;KdSOC1在大叶落地生根叶齿隙间和不定芽顶端表达且与生长素的分配有关。转KdSOC1烟草芽尖分生组织中开花相关的LEAFY等4个基因上调表达。转KdSOC1烟草在长日照/(或)短日照条件下,顶芽促花基因LEAFY相对表达量较野生型提高2.6/2.4倍(P<0.05);赤霉素合成关键基因GA20 0xidase相对表达量提高1.1/2.8倍(p<0.05),生长素细胞膜受体蛋白编码基因ABP1、运输蛋白编码基因PIN1相对表达量分别提高1.7/1.0倍和3.5/4.1倍(p<0.05)。KdSOC1提高烟草叶片在长日照条件下的光合速率和生长素含量。转KdSOC1烟草和野生型植株在长日照条件下,叶片叶绿素含量分别为0.47 mg g-1和0.35 mg g-1(p<0.05);光合速率在600 μmol m-2 s-1光照条件下分别为4.01μmol CO2 m-2s-1和2.85 μmol CO2 m-2 s-1(p<0.05);生长素(IAA)含量分别为 407 pgmg-1 和 287 pgmg-1(p<0.05)。在短日照条件下,转KdSOC1烟草和野生型植株叶片生理指标没有明显差异,叶绿素含量0.35 mg g-1和0.36 mg g-1,光照强度0-1400 μmol m-2 s-1的光合速率变化在误差范围内,生长素(IAA)含量分别为252 pgmg-1和为297 pgmg-1。转KdSOC1大叶落地生根叶片形态和生长素与细胞分裂素含量的比例有关。转KdSOC1基因大叶落地生根较野生型,叶片长/厚度分别为3.5 cm/2.59 mm(1.4/1)和 5.1 cm/1.80 mm(2.8/1)[转空载体植株为 4.5 cm/1.79 mm(2.5/1)],叶片叶缘附近的纵切面叶脉维管束宽度(直径)平均为18.9 μM和9.0μM(p<0.05)。转基因植株叶片的KdSOC1相对表达量较野生型提高5.6倍,生长素运输蛋白编码基因PI-N1的相对表达量提高2.5倍(p<0.05);转基因与野生型植株叶片生长素(IAA)/细胞分裂素(ZT)含量分别为 105.3 pg mg-1/260.3 pg mg-1(1/2.5)(p<0.05)和 80 pg mg-1/290 pg m-1(1/3.6),转空载植株83 pg mg-1/287 pg mg-1(1/3.5)。这表明转化植株叶片缩短加厚,维管束直径增大与KdSOC1提高PIN1的表达量和IAA含量相关。KdSOC1启动子具有组织特异性且驱动活性与生长素IAA响应有关。转35S-GUS烟草种子(T1代)诱导的愈伤组织和不定芽均被染成蓝色,而转KdSOC1启动子-GUS的烟草种子(T1代)诱导的球形胚和不定芽顶端被染成蓝色。转35S-GUS烟草种子(T1代)在含有生长素TIBA或NPA(IAA抑制剂)的培养基上诱导培养,上述组织被染成蓝色;而转KdSOC1启动子-GUS的上述组织均未有蓝色显现。KdSOC1影响不定芽发生过程中生长素的分布与响应。响应IAA驱动的DR5-GUS拟南芥植株,其种子(T1代)诱导的胚性愈伤组织、球形胚、心形胚均被染成蓝色;导入KdSOC1的DR5-GUS拟南芥植株,其种子(T1代)诱导的球形胚周围、心形胚(初期和末期)胚状结构以外的区域被染成蓝色。转KdSOC1启动子-GUS大叶落地生根在叶齿隙不定芽原基形成之前被染成蓝色,之后不显色。该结果表明KdSOC1响应生长素信号并影响原基的形成从而调控大叶落地生根不定芽的发生。3.KdN41受干旱诱导在叶脉表达,调控烟草植株提前开花。干旱条件下KdN41启动子驱动GUS在烟草叶脉组织中表达。转KdN41启动子-GUS烟草经过干旱处理后叶脉组织被染成蓝色,正常浇水的转KdN41启动子-GUS烟草植株叶脉组织未见蓝色显现;野生型叶片注射转化KdN41-YFP融合基因后48 h,以共聚焦显微镜观察到其叶片表皮细胞核和细胞膜有KdN41-YFP融合蛋白荧光。外源生长调节剂影响大叶落地生根叶片中KdN41的表达量。大叶落地生根叶片喷施植物生长调节剂4h和6h后(与喷施水处理相比),喷施水杨酸的叶片,KdN41表达量分别提高0.8和3.7倍(p<0.05);喷施茉莉酸甲酯则分别降低0.58和0.57倍(p<0.05)。水杨酸对KdN41表达量的影响较大。转KdN41烟草经过干旱处理比野生型早开花。烟草野生型、转KdN41及转空载体的植株在长日照条件下培养至84 d,经自然干旱处理10 d后(土壤相对含水量为10%)复水正常养护,转KdN41烟草培养至147 d开花;野生型及转空载烟草培养至168 d开花;转KdN41植株开花提前21 d。