随着社会日益进步,水稻耕作方式也随之发生了根本性改变,即实现了从对劳动力高度依赖的精耕细作到抛秧、直播及机械化等轻简栽培方式的转变。与之相伴的是除草剂的普遍施用以解决更加严重的杂草危害问题。杂交水稻是联合国粮农组织推荐的保障世界粮食安全的首选技术,但因现行种子生产技术制种要求与成本高,制约了其在国内外的进一步发展。培育抗除草剂水稻品种、品系,可以减轻除草剂施用对水稻生长的影响、解决杂交稻种子高成本及纯度问题,具有重要的实际意义。本论文选择细胞核单基因控制靶标抗性的两种非选择性除草剂——咪唑啉酮类除草剂和草甘膦,作为抗性筛选除草剂,结合自然变异分析、化学诱变剂处理及基于蛋白结构的定向进化分析与设计,创制了在水稻中首次报道的咪唑啉酮类除草剂抗性突变、草甘膦耐受性增强的全新突变。主要研究结果如下:（1）化学诱变创制咪唑啉酮类除草剂抗性水稻种质及应用研究通过EMS诱变处理华航31水稻种子,在M2代利用高浓度咪唑乙烟酸进行加压筛选,获得了3种类型的抗性突变Ala179Val、Ser627Asn、Gly628Glu。其中Ser627Asn与Gly628Glu为国外抗除草剂水稻主要利用的抗性位点,而Ala179Val为首次在水稻中报道的抗性突变。用不同浓度的咪唑乙烟酸包衣Ala179Val、Ser627Asn、Gly628Glu抗性突变系种子,其中Ala179Val、Ser627Asn在0.5%至5%的豆施乐?浓度包衣下,均能正常萌发生长且保持与未加除草剂对照一致的长势;而Gly628Glu则在3%、5%的浓度下无法正常萌发生长,在0.5%、1%的浓度下幼苗长势较未包衣对照明显变差;野生型华航31在4种浓度的除草剂包衣下,均无法正常萌发。3种抗性基因杂合品系在除草剂浓度梯度包衣实验中,与抗性基因纯合品系表现了一致的结果,说明利用Ala179Val、Ser627Asn两个抗性种质培育杂交稻父本,结合杂交种子除草剂包衣,可以去除其中的不育系自交种子或与不抗除草剂父本串粉来源种子。（2）利用CRISPR/Cas9技术创制既抗咪唑啉酮类除草剂又对苯达松敏感的水稻种质及应用研究在咪唑啉酮类除草剂抗性突变Ala179Val的基础上,通过CRISPR/Cas9技术敲除苯达松抗性基因Os CYP81A6,获得了既抗咪唑啉酮类除草剂又对苯达松敏感的水稻种质Oscyp81a6。0.5%排草丹?单独包衣以及0.5%排草丹?+0.5%豆施乐?同时包衣Oscyp81a6敲除系,都能使其无法正常萌发生长;而未包衣对照与华航31（Ala179Val）抗性突变系均能正常生长且长势一致。因此,在今后的杂交水稻轻简化制种过程中,可利用既抗咪唑啉酮类除草剂又对苯达松敏感的水稻品系作为父本与任意母本（具有苯达松天然抗性基因）杂交获得F1,F1对咪唑啉酮类除草剂和苯达松双抗,而父本、母本自交种都只抗一种除草剂,利用两种除草剂包衣可以在萌发阶段杀死父、母本自交种,保证正常长出的全部为双抗杂交稻,可同时实现两系杂交稻混播混收机械化制种及除杂保纯。（3）基于EPSPS蛋白结构分析的定向进化创制水稻抗草甘膦种质在自然变异挖掘与EMS诱变处理,都未能获得草甘膦抗性水稻的情况下,本研究通过创制缺陷型大肠杆菌Δaro A+ΔC-Plyase,构建了原核表达系统Os EPSPS突变型草甘膦抗性鉴定体系。在此基础上,基于对EPSPS蛋白结构分析与理性设计,利用原核草甘膦抗性鉴定体系,鉴定了大量Os EPSPS蛋白突变型,最后筛选到两个底物进入通道的关键氨基酸,通过对它们的饱和突变鉴定,确认N398S+D422F、N398C+D422F两组双突变具备草甘膦耐受性,转基因拟南芥与水稻也验证了这一结果。该两位点为未见报道的全新抗性位点,也是首次基于EPSPS蛋白结构理性分析获得的抗性突变,为今后研创抗草甘膦植物提供了新的思路。（4）基于3000份水稻品种重测序数据,进行Os EPSPS与Os ALS的自然等位变异及蛋白保守性分析Os EPSPS与Os ALS基因在水稻自然资源中非常保守,所有已报道的抗性突变位点均在这两个蛋白的保守区域。不同于EPSPS的抗性位点位于蛋白活性中心,ALS的抗性位点均位于底物进入通道处。而自然资源中的非同义突变均发生在蛋白的非保守区域,经过除草剂处理后,未发现3K水稻种质中存在抗性突变。