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本论文以质粒pVAXl和pGL3-control为基础,辅以重要元件(CpG免疫基序、核靶向序列、asd基因等),利用类生物学合成方法构建出一种新颖的通用型DNA疫苗载体,命名为pkDNA。酶切连接绿色荧光蛋白基因(egfP)’体外转染COS-7细胞证实该质粒具有pVAXl相似的真核表达能力。选取鸭瘟病毒gB糖蛋白膜外区域编码基因和UL24基因为抗原基因,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli LTB)基因和鸭IL-2mRNA反转录cDNA为分子佐剂构建多种鸭瘟病毒DNA疫苗质粒。以c8276 Acrp/cya(鼠伤寒沙门氏菌UK-1 △asd｛crp△cya缺失株)为口服免疫途径递送活菌载体,20日龄麻鸭口服免疫重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗两次,均能产生较高的体液及粘膜免疫应答,并在一定程度上抵抗鸭瘟病强毒株的挑战,其中c8276△crp/cya (pkDNA-UL24-LTB)组效果显著。结果如下：一种新颖通用型DNA疫苗载体的构建：利用类生物学合成方法合成全新DNA疫苗载体pkDNA:以UK-1基因组、pVAX1和pGL3-control为模板PCR扩增获得基因片段asd, pUC、CMVMCS、BGH poly(A)、SV40 enhancer和SV40 late poly(A)片段：重叠PCR两两融合构建三模块片段：(1/2DTSII+asd/+CpG+PUC)、(BGH poly A+CpG+SV40 enhancer)和(MVMCS+CpG+SV40 polyA+1/2DTSII);最后利用Gibson Assembly(?) Master Mix(New England Biolabs(?)inc.)完成pkDNA质粒的类生物合成。两次测序结果表明与理论序列相符,酶切连接绿色荧光蛋白基因(egfp),直接荧光法可见绿色荧光蛋白在COS-7细胞中很好的表达,其真核表达能力与pVAX1相似。鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及其体外表达能力检测：PCR扩增tgB(451-1650bp)、 UL24、LTB、和鸭IL-2基因；重叠PCR扩增得到UL24-LTB. UL24-DuIL2融合片段。单抗原基因及融合基因酶切连接pkDNA,完成鸭瘟病毒DNA疫苗质粒:pkDNA-tgB、 pkDNA-UL24、pkDNA-UL24-LTB、pkDAN-UL24-DuIL2,测序鉴定无误。所有DNA疫苗质粒瞬时转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测转染24小时后的细胞,均可见强烈的绿色荧光信号,而空质粒转染组及空白组荧光不明显；48小时后,收集细胞,提取总RNA, RT-PCR检测可见pkDNA-UL24-LTB和pkDNA-UL24-DuIL2转染组中佐剂基因特异性转录。c$276△crp/cya弱毒株及重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗菌株的构建：以鼠伤寒沙门氏菌c8276(UK-1△ash/)△crp缺失株为亲本构建c8276 △crp/cya弱毒株,经PCR及麦康凯(麦芽糖+)平板鉴定表明突变株构建成功。鸭瘟病毒DNA疫苗质粒电转c82776△crp/cya,获得系列重组沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗菌株：c8276△crp/cya (pkDNA-tgB)、c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、c8216△crp/cya (pkDNA-UL24-LTB)、 c8276｛crp/cya(pkDAN-UL24-DuIL2), c8276△crp/cya(pVAXl-UL24)及 c8276△crp/cya (pkDNA);LB平板上连续划线培养20代,PCR鉴定显示DNA疫苗质粒在c8276Acrp/cya中遗传稳定性良好,且不影响菌株生长；7日龄麻鸭口服接种高达1012CFUc8276Acrp/cya(pkDNA),两周内小鸭食欲饮欲正常,剖检各器官组织无任何病症现象,重组疫苗安全性良好。重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗免疫效果研究：20日龄麻鸭随机分成7组,记为A-G:A.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、B.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24-LTB)、 C.c8276△crp/cya(pkDAN-UL24-DuIL2)、D.c8276△crp/cya(pkDNA-tgB)+c8276△crp/cya (pkDNA-UL24)、E.c8276△crp/cya(pVAX1-UL24)、F.c8276Acrp/cya(pkDNA)及G.BSG组,每组15只,每只口服免疫1012CFU重组疫苗菌株,共免疫两次,每次间隔2周。一免后第10天、21天和28天每组随机挑选6只采集血清,一免后第21天,每组随机选取5只采集胆汁及十二指肠粘液,分别检测针对tUL24蛋白及DEV病毒颗粒的抗体应答水平,二免两周后DEV强毒株CHv经口攻毒检测疫苗保护力水平。结果显示：B组诱导最高的胆汁IgA抗体水平(P<0.05),B组和C组产生的血清IgY抗体水平高于其他组(P<0.05),D组麻鸭产生更高的抗DEV的抗体水平比起抗tUL24；所有实验组(A-D)和阳性对照E组产生的抗体水平显著性高于F和G组(P<0.01)；攻毒12天后B组存活率最高(9/10),D组随之7/10,C与E组相同6/10,A组偏低仅5/10,均明显高于F(2/10)和G组(0)。