乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一，全球有3.5亿HBV感染者，其中1/3以上在中国，目前仍缺乏十分有效的治疗方法。因此，对乙型肝炎病毒的研究是世界各国（尤其是中国）十分关注的课题，制备合适的HBV复制模型对于HBV的研究具有重要的意义。　　嗜肝DNA病毒包括哺乳动物病毒属和禽病毒属，来自各不同动物的HBV毒株，具有严格的种属特异性，人HBV按照全基因组核苷酸序列的差异，可分为A-H8个基因型，不同的基因型，除了在地区分布的差异外，在致病性、临床感染的结局及抗病毒疗效方面也存在差异。因此，也有必要建立不同基因型HBV复制模型。　　HBV感染在西方国家主要是D和A基因型，而在我国则以B、C基因型为主。尽管有学者构建了B、C基因型HBV克隆，但并非经过筛选得，对其分子生物学特性也缺乏深入研究，因此，目前我国学者在HBV研究时，几乎均采用了国外广泛传送的D基因型HBV质粒，所应用的的细胞模型也为国外构建的分泌D基因型HBV的HepG2.2.15细胞。由于传代多年，其HBsAg、 HBeAg及HBV DNA的表达均较低，难以达到检测水平。四环素(Tetracycline，Tet)诱导的基因表达系统是近年来新发展的真核细胞基因表达系统。孙殿兴等曾于2006年报道应用Tet系统构建了HBV可调控性复制的HepG2.117细胞系，这一细胞的HBV DNA分泌量较HepG2.2.15细胞高十余倍。本课题选择具有高水平HBV复制者，自血清中分离B/C基因型HBV基因组，经转染肝癌细胞系，筛选具有高效复制与高效表达的HBV，检测其分子生物学特性，建立了B/C基因型HBV标准中国株，并利用Tet系统建立了高效复制的HBV复制模型。实验由以下4部分组成:　　第一部分、HBV B/C基因型与拉米夫定治疗应答的相关性分析　　目的:分析HBV B/C基因型与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的应答的关系。　　方法:应用CLEIA方法检测HBeAg和抗-HBe，应用RT-PCR方法检测HBV DNA，基因型检测采用限制性片段长度多态性分析(RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism)，统计学软件应用ReviewManager5.1和Stata11。数据资料选取自2011年3月之前的PubMed，Webof Science，Science Direct，and CNKI数据库。　　结果:　　1.经搜库我们选择了332篇拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的相关文献，其中16个RCTs，共包括3148个患者，其中10个RCTs（包括1860个患者）为拉米夫定治疗后HBV DNA阴转，其中9个RCTs（包括1288个患者）为拉米夫定治疗后HBeAg清除。　　2.从10篇拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的文献分析，B基因型与C基因型两组比较，RR值为1.07(0.98-1.17)，HBV DNA阴转与B/C基因型无明显相关性。　　3.从9篇拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的文献分析，B基因型与C基因型两组相比较，RR值为1.27(0.94-1.71)，HBeAg清除率与B/C基因型无明显相关性。　　结论:HBV B/C基因型与拉米夫定治疗应答无相关性（治疗应答包括HBeAg清除和HBV DNA阴转）。　　第二部分、HBV基因分型方法的建立　　目的:建立HBV基因分型的简便方法;观察不同HBV基因型在中国华北地区的分布情况及其临床相关性;寻找具有高水平HBV复制的HBV感染者。　　方法:选择在石家庄市两所医院中住院的HBV DNA＞104 copies/mL慢性乙肝患者587例，常规方法提取HBV DNA，应用我们设计制备的多重PCR方法扩增HBV DNA，按照琼脂糖凝胶电泳DNA片段大小判断其基因型，根据临床资料分析不同基因型的病情差异，观察不同基因型HBV对抗病毒药物的应答水平。　　结果:应用多重PCR方法进行HBV基因分型，587例HBVDNA＞104copies/mL的血清标本中，B基因型89例(15.2％)，C基因型498例(84.8％)，未发现A、D型。在这些HBV感染者中，HBV DNA定量分析，C基因型明显高于B基因型。C基因型HBV感染者较B型者病情相对较重，两组具有显著差异（P＜0.01），B、C基因型两组临床诊断所占比例分别是:慢性肝炎轻度52.81％和10.04％，中度24.72％和9.05％，重度10.11％和20.28％，肝硬化代偿期10.11％和27.31％，肝硬化失代偿期2.25％和27.11％，肝癌0.00％和6.22％。拉米夫定和普通干扰素对B基因型的疗效优于C基因型。　　结论:中国华北地区流行的HBV基因型主要是B、C基因型，其中C基因型为中国华北地区绝对优势毒株;C基因型HBV DNA定量明显高于B基因型;具有C基因型的HBV感染者，其肝病的严重程度明显重于B基因型者，拉米夫定和普通干扰素对B基因型的疗效优于C基因型。通过本研究，获得了具有高水平HBV复制者的血清，为后续克隆高度复制的HBV基因组奠定了基础。　　第三部分、B/C基因型HBV中国株克隆与生物学特性的分析　　目的:鉴于目前多数研究以D基因型HBV为模型，缺乏可信的B/C基因型HBV复制与表达质粒，本研究从具有高水平HBV复制的HBV感染者血清中，分离筛选具有高水平复制与表达的HBV病毒株，构建其表达质粒并观察其一系列分子生物学特性，以建立B/C基因型HBV中国株模型。　　方法:　　1.HBV基因克隆:采用文献报道的方法(Gunther S，JVirol.1995;69:5437-5444)。设计引物，高保真PCR扩增全长HBV DNA，PCR片段3端加A后，应用T4连接酶连接到T载体上，以构建pUC-HBV3.2质粒。　　2.1.05倍和1.3倍HBV复制型质粒的构建:以环状HBV基因组为模板，利用两个PCR片段，同时插入载体质粒，以保证HBV首尾重复区域。　　3.感受态大肠杆菌TOP10的制备与转化:参考《分子克隆》方法。　　4.细胞培养及质粒转染:细胞培养用含10％FBS、青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L高糖DMEM培养液于37℃、5％CO2孵箱中培养。质粒转染应用Roche公司生产的FuGENE(@)HD。　　5.HBsAg和HBeAg:应用化学发光法定量检测。　　6.HBV DNA的检测:Native Southern Blot或普通Southern Blot，应用α32p同位素标记的全长HBV DNA探针杂交。　　7.B、C基因型HBV的感染性实验:在诱导HepaRG细胞分化后，感染已知滴度的HBV。最佳克隆pUC-HBV1.3质粒B2-2和C7-5，转染HepG2细胞，取细胞上清液，沉淀浓缩病毒，感染经诱导分化后的HepaRG细胞。ELISA法检测上清液中HBsAg，PCR定量检测HBV DNA。　　8.Western blot:应用mc312po与mc158po混合抗体检测核心蛋白的表达，9H9与4/7B混合物检测囊膜蛋白。　　结果:　　1.HBV基因克隆:选择较高滴度B/C基因型HBV感染者血清各10份，碱裂解法提取HBV DNA，采用文献报道的方法把全长HBV DNA连接到T载体上，经蓝白筛选及质粒大小鉴定，共成功构建了111个pUC-HBV3.2质粒，其中B型49个、C型62个。　　2.初步筛选具有复制与表达能力的HBV克隆:包含了HBV全基因组的pUC-HBV3.2质粒，用BspQⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳后切取3.2 kb条带，用凝胶DNA提取试剂盒提取DNA，各取2μg DNA，转染HepG2细胞，4天后收集上清液，定量检测HBsAg和HBeAg水平，收集细胞裂解液应用Native Southern Blot方法检测HBV DNA，发现这111个克隆表达水平不同，其中B2-2和C7-5最佳。　　3.初筛获得的HBV克隆的复制与表达水平检测:选取HBsAg和HBeAg表达及HBV DNA复制最强的C基因型1株、B基因型2株，进一步应用PCR方法分别将其克隆至pTRE2Hyg及pUC18质粒上，以构建1.05及1.3倍可复制的HBV质粒。以D基因型为对照，转染G2TA2-7细胞后，Southern Blot检测HBV DNA，化学发光法检测HBsAg和HBeAg水平。发现仍然以B2-2和C7-5最佳，但复制水平稍弱于目前通用的D基因型HBV质粒。　　4.HBV结构蛋白完整性的检测:经Western Blot方法检测囊膜蛋白和核心蛋白的表达，发现1.05倍HBV质粒转染HepG2后囊膜蛋白和核心蛋白的表达高于1.3倍HBV质粒。　　5.HBV感染能力的检测:上述筛选获得的最佳克隆pTRE-HBV-C7-5和pTRE-HBV-B2-2质粒，转染HepG2细胞后，收集细胞培养上清液，PEG8000浓缩病毒，感染经诱导分化后的HepaRG细胞，第1、2、3、4、5、6、7天分别收取细胞上清液，定量检测上清液中HBsAg、HBeAg，发现在感染后第6天抗原分泌水平达到最高峰。证明了其感染过程。　　6.新构建的B/C基因型HBV质粒对常用核苷类似物敏感性的研究:通过质粒瞬时转染，并应用不同浓度的拉米夫定处理，5天后收集细胞裂解液，Southern Blot证实了对拉米夫定的敏感性，随着拉米夫定剂量的增大，对HBV复制的抑制作用增强。　　结论:本研究从高滴度HBV血清中扩增得到HBV基因组，检测其复制及表达水平，构建了高效复制、高效表达、具有感染性的B/C两种基因型HBV质粒，由于其对拉米夫定敏感，证明了其可作为HBV复制的模型。通过本研究，成功地构建了B/C两种基因型中国株HBV。　　第四部分、B/C基因型HBV中国株稳定复制细胞系的构建　　目的:填补缺乏B/C基因型HBV复制细胞系的空白，方便未来HBV实验研究，本研究构建高效表达与可调控性复制的B/C基因型HBV稳定复制细胞系，并检测其分子生物学特性。　　方法:　　1.细胞克隆的筛选:取pTRE-HBV(B2-2，B10-1，C7-5)质粒，转染Tet可调控性细胞系G2TA2-7细胞，以含400μg/mL G418和180μg/mL潮霉素的培养液筛选抗性细胞克隆。4W后，形成细胞克隆，各挑取细胞克隆24-36个，接种于24孔板继续扩大培养。调整细胞密度一致后，荧光定量PCR检测细胞培养上清液中HBV DNA，化学发光法检测HBsAg，各选择6个HBVDNA水平和HBV抗原表达水平最高者，在无抗生素筛选条件下，连续培养20代（大约4个月）。　　2.细胞培养、HBsAg和HBeAg的定量检测、HBV DNA的检测方法同第二部分。　　结果:　　1.经抗生素筛选获得了B/C两种基因型HBV细胞克隆两种基因型HBV质粒转染G2TA2-7细胞后，经G418和潮霉素筛选，获得大量细胞克隆，各挑取细胞克隆24～36个，根据细胞培养上清液中的HBV DNA水平，共选择其中24个细胞克隆在无抗生素选择压力下连续传代4个月，再次检测细胞培养上清液中HBV DNA，发现发现部分细胞克隆分泌HBV的水平下降，但仍有8个细胞克隆保持高水平复制。　　2.Southern Blot显示B/C两种基因型HBV细胞克隆保持复制能力B2-2和C7-5两组各4个细胞株，在无抗生素选择压力下连续传代4个月，经Southern blot检测发现均有较高复制水平。Southern Blot显示有松驰环状、双链和单链HBV DNA的形成，B2-2-21和C7-5-83表达最佳。　　3.所构建的细胞系，呈现可调控性HBV复制B2-2-21和C7-5-83在无抗生素选择压力下连续传代4个月，经SouthernBlot检测发现，在细胞培养基中含有强力霉素时，HBV复制受到抑制，证明所构建的细胞系呈调控性复制，复制能力比Hepa2.2.15增强，HBsAg和HBeAg的表达均比Hepa2.2.15增强。　　4.作为HBV复制的细胞模型，对拉米夫定敏感B/C基因型各选择一个最佳细胞系，加拉米夫定终浓度0，0.1，0.5，2.5，12.5 uM，5天后，取细胞裂解液提取HBV DNA，Southern Blot检测，发现随着拉米夫定浓度的不断加大，HBV复制受到抑制，但对HBsAg无影响。　　结论:成功构建了B、C基因型HBV中国株可调控性复制细胞系，可作为细胞模型用于HBV复制研究以及筛选抗HBV药物等。