研究背景肺癌(亦称原发性支气管肺癌)是目前全球第一位恶性肿瘤,统计显示,肺癌发病率达20.6-48.2/10万人次,2012年约诊断肺癌182万例,死亡159万例,全世界新发病例数以每年约3%的速率增加,我国每年肺癌约新增40万例,死亡36万例,患者生存质量差、病死率高,且发病率呈逐年上升趋势,严重威胁生命安全。肺癌发生发展是多种因素参与的复杂多样的生物学过程,病因和发病机制较为复杂,环境污染、吸烟、职业暴露、既往慢性肺部疾病、人口老龄化、肿瘤家族史等均与肺癌发生具有关系。目前,手术切除能够切除肿瘤以及转移或潜在转移病灶及淋巴结是唯一可能根治的方法,但是肺癌患者早期症状不明显、无法早期诊断,耽误了手术时机。化疗是采用化学药物(顺铂及卡铂等铂类化疗药物等)作用于DNA链间及链内交链,形成DDP~DNA复合物,干扰DNA复制,进入细胞核后与核内DNA结合,导致DNA不可逆性损伤,细胞无法正常新陈代谢,引起有丝分裂肿瘤细胞死亡从而发挥其抗癌作用,成为肺癌的治疗手段之一。肿瘤细胞的耐药性,包括原发性耐药与获得性耐药,是肿瘤细胞的自我保护机制之一。由于肿瘤细胞内存在DNA损伤修复机制,如果DNA修复基因的修复能力增强,则可能产生化疗耐药,影响化疗药物临床治疗效果。原发性耐药是遗传学基础的耐药性,由于基因突变、缺失,或是基因扩增、移位,染色体的重排而产生耐药克隆,获得性耐药是由于细胞动力学原因,由不分裂或休眠期的肿瘤细胞产生,化疗药物造成的DNA损伤部分可由细胞通过募集DNA损伤修复相关因子进行修复,因此,研究肺癌肿瘤细胞耐药性发生的主要机制有助于改善患者预后。PLK1属于高度保守的、调节有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸激酶PLKs家族的成员,与分裂期进入、中心体成熟、cohesin黏合释放、高尔基体裂解、微管连接着丝粒、纺锤体伸长有关,在细胞周期过程中DNA损伤检验点、中心体成熟、染色体浓缩、染色体分离、胞质分裂等细胞增生及分离的不同时期中起重要调节作用,还与DNA损伤应答、肿瘤形成、胚胎早期发育等密切相关,参与遗传信息的损伤修复等。PLK1可能参与肺癌的发生发展过程,其表达水平与功能在肺癌的发生、发展、侵袭、转移中发挥重要作用,而且在肺癌细胞对化疗药物耐药机制充当重要角色。GST-π、CK2β、p53、P-gp、Ki67靶向信号通路关键因子活化诱导癌细胞表达,继而增强其活性能够调节癌细胞的转移侵袭以及化疗抗性,可促进恶性肿瘤的细胞增殖同时抑制肿瘤细胞的凋亡,并且增加肿瘤细胞的多重耐药现象。综上所述,PLK1表达不仅在肺癌的发生发展中可能发挥着重要作用,而且可能与化疗敏感性及患者预后存在相关性。本课题拟采用病例对照研究设计,通过以关联研究方法为线索,应用免疫组化、聚合酶链反应技术对肺癌组织及癌旁组织等PLK1表达水平进行检测,探讨其与肺癌患者预后的关系,同时分析抑制PLK1表达后,耐铂A549细胞对化疗药物顺铂的敏感性变化。本课题的完成将有助于揭示肺癌患者化疗敏感性的主要机制,进而为寻找有效且安全的抗癌疗法,解决肺癌化疗过程中耐药性困扰提供新的思路和方案。目的比较非小细胞肺癌组织、癌旁组织PLK1表达水平差异,探讨PLK1表达与肺癌病理特征以及预后的相关性,同时分析抑制PLK1表达后,A549细胞对化疗药物顺铂的敏感性变化,进而为寻找有效且安全的抗癌疗法,解决肺癌化疗过程中耐药性困扰提供新的思路和方案。方法收集2014年1月~2014年12月深圳市第二人民医院病理确诊的非小细胞肺癌患者85例(病例组)基线资料,采用病例-对照研究的方法,选取同期气胸肺大疱切除或其他良性疾病的正常肺组织标本100例(对照组),相同地区同期且性别、年龄与病例组相匹配。采用免疫组化、聚合酶链反应进行PLK1蛋白及PLK1 m RNA表达检测。采用BI2536抑制PLK1表达并经铂处理后,对细胞周期分布进行流式细胞分析,对细胞凋亡形态学变化进行染色分析,对PLK1的表达变化和肿瘤细胞中E-cadherin及N-cadherin表达水平的变化采用Western blot法分析,Transwell方法检测A549转移侵袭能力的变化。对比两组基础资料,对比分析BI2536抑制PLK1并经铂处理后细胞周期分布、细胞凋亡形态学变化。PLK1抑制后肿瘤细胞中E-cadherin及N-cadherin表达水平的变化。统计分析采用SPSS20.0软件,P<0.05为有显著统计学差异。结果⑴基线资料统计提示,两组患者基础资料指标间均不存在较大的差异,符合对照研究的客观要求。⑵PLK1阳性细胞主要在细胞胞浆表达,NSCLC组织PLK1表达水平(计分)为4.89±1.87,癌旁组织为1.21±1.46,正常组织为0.44±0.86,NSCLC组织的表达水平显著高于癌旁组织及正常组织。NSCLC组织表达阳性率为92.94%(79/85),癌旁组织为35.29%(30/85),正常组织为14.00%(14/100),差异具有统计学意义。⑶肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移以及PLK1表达对患者3年生存率有明显影响,,见表3。肿瘤>4cm以及PLK1表达阳性是患者3年生存率的独立危险因素。⑷NSCLC癌组织GST-π、CK2β、P-gp、Ki67、p53的表达阳性率分别为91.76%(78/85)、74.12%(63/85)、64.71%(55/85)、57.65(49/85)、67.06%(57/85),显著高于癌旁组织和正常组织组,且癌旁组织GST-π、CK2β、P-gp、Ki67、p53的表达阳性率显著高于正常组织。PLK1表达与GST-π、CK2β、p53、P-gp、Ki67具有正相关,r分别为0.999、0.984、0.996、0.984、0.993。⑸NSCLC癌组织PLK1 m RNA为0.59±0.15,显著高于癌旁正常组织0.43±0.17,差异具有统计学意义。⑹PLK1 m RNA表达与患者年龄、性别无明显相关性,低分期和中高分期PLK1 m RNA表达存在明显差异,低分化和中高分化PLK1 m RNA表达存在明显差异,>4cm的NSCLC患者PLK1 m RNA为0.65±0.19,显著高于≤4cm的组织,远处转移及淋巴结转移的PLK1 m RNA表达显著高于无转移的组织。生存率<3年的PLK1 m RNA为0.67±0.17,显著高于生存率≥3年患者。⑺PLK1抑制剂与细胞共孵育后,实验组PLK1相对表达水平为0.502±0.087,对照组PLK1相对表达水平为1.128±0.103,具有明显统计学差异,提示抑制剂可以明显降低细胞内PLK1表达水平,对PLK1有明显的抑制作用。⑻随着顺铂浓度提高,实验组较对照组中细胞凋亡率显著提高,差异有统计学意义。实验组中A549细胞阻滞在G2/M期,与对照组相比差异显著,具有统计学意义。⑼在培养液中加入抑制剂之后,E-cadherin的表达水平由0.95±0.12上调为1.26±0.24,而N-cadherin的表达水平由0.92±0.17下调为0.63±0.12,差异具有统计学意义。⑽Transwell方法检测A549转移侵袭能力的变化。结果显示,抑制PLK1后A549侵袭转移能力显著降低。结论(1)PLK1水平高低与非小细胞肺癌患者预后存在显著的相关性,可临床作为评估非小细胞肺癌预后的特异性指标。(2)PLK1在非小细胞肺癌中的生物功能主要涉及转移侵袭和化疗抗性调控两方面,并且与GST-π、CK2β、P-gp、Ki67、p53等蛋白表达存在正相关性。(3)抑制耐铂A549细胞内PLK1表达后,可提高顺铂化疗敏感性,耐铂A549细胞转移侵袭能力下降。