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(1)群体感应系统(quorum sensing, QS)是细胞浓度决定性网络系统,它调控着细胞内很多复杂的代谢过程。1970年,科学家在费氏弧菌中首次揭示出了QS系统,随后很多革兰氏阳性菌与阴性菌的QS系统相继被揭示。在近些年,随着人们对QS系统研究的深入,人们也开始利用QS系统来为人类服务。(2)植物乳杆菌ZJ316是一株具有良好抗菌活性的乳酸菌,与大多数乳酸菌一样,其细菌素产生也是通过QS调节的。通过全基因组测序,我们发现植物乳杆菌ZJ316的QS系统缺少反馈调节因子p1nC/p1nD基因。因此我们希望对植物乳杆菌ZJ316的QS进行改造,可以调控其细菌素的产量。(3)本实验己筛选得到了几株抑菌效果较好的植物乳杆菌,通过提取其基因组,并以此为模板进行PCR,确定目的基因p1nC、p1nD,并通过割胶回收获得目的基因。对目的基因进行双酶切,连接质粒PNZ8048,成功构建出重组质粒p1nC-PNZ8048、p1nD-PNZ8048,并保存于E.coli DH5α中保存。(4)植物乳杆菌ZJ316作为野生菌,其电转化条件并不明确,因此我们对植物乳杆菌Z1316电转化条件进行摸索,发现当细胞培养至OD6001.1,用10 g/L溶菌酶37℃处理细胞1h,使用甘油／蔗糖溶液作为电转化缓冲液处理转化效率最高。通过最优条件,我们成功获得了p1nC-PNZ8048-ZJ316、p1nD-PNZ8048-ZJ316基因工程菌。通过对基因工程菌生长曲线的测定,我们发现质粒转化后,对菌体生长影响不是很明显,同时也为基因工程菌的诱导表达打下了一定的基础。(5)基因工程菌的生长曲线与野生菌相似,但它们的诱导表达条件还是有所不同,因此需要进行正交实验。实验结果表明,最优诱导条件是在MRS液体培养基中加入15 ng/mL氯霉素,并在30℃培养,至OD6000.4加入2 ng/ml Nisin诱导16 h,发现在27KDa附近出现了目的条带。进一步通过抑菌实验发现,p1nC-PNZ8048-ZJ316对柠檬色葡萄球菌的抑制效果与野生菌并没有明显的差别,p1nD-PNZ8048-ZJ316对柠檬色葡萄球菌的抑制效果有明显的下降。P1nC、P1nD作为一对反馈调节因子,可以调节细菌素的产生,P1nC作为激活因子,并没有对细菌素的产生有明显的激活作用,而P1nD却展现出了其一定的抑制作用,基因工程表达虽然可以让我们单独研究P1nC、P1nD的作用,但是还是具有一定的缺陷,其表达产物或多或少会带有多余的氨基酸序列,从而可能会影响目的蛋白的功能.。(6)虽然我们初步确定了P1nC、P1nD的功能,但是由于基因工程的缺陷,P1nC并没有出现预想的结果,同时我们也未得到更高抑菌活性的植物乳杆菌。植物乳杆菌ZJQ的抑菌活性也具有不错的抑菌活性,因此我们希望可以通过原生质体融合技术,改造植物乳杆菌ZJ316。原生质体融合技术是一种可以快速高效的改变微生物性状的生物技术手段,它有着其他技术无可比拟的优势,可以克服种间的不育性,使融合子同时具有双亲的优良性状。我们希望可以通过植物乳杆菌ZJ16与植物乳杆菌ZJQ进行融合,获得具有良好抑菌活性的植物乳杆菌。(7)通过原生质体融合技术,我们成功获得了融合子,并对融合子进行电镜观察,发现融合子细胞形态较野生菌株有所加长,且进行SDS-PAGE分析,发现融合子兼有两亲本的蛋白条带,可以证明两菌株成功融合,进行抑菌实验。实验结果发现,融合子的抑菌效果,相较两亲本有明显的提高。