Gly m Bd 28K是大豆的主要过敏原之一,它能够诱导人体产生免疫反应,威胁人体健康。IgG类抗体能够参与免疫反应四种机制的两种,在免疫反应中占据重要地位。目前,关于Gly m Bd 28K的致敏机理以及它的哪一部分能与IgG抗体结合的报道甚少。因此,本研究利用生物信息学软件对Gly m Bd 28K的三级结构模型和B细胞表位进行了预测,并利用Gly m Bd 28K多克隆抗体和单克隆抗体分别与Gly m Bd 28K重叠多肽反应,鉴定出了Gly m Bd 28K上的三个主要的线性IgG结合表位,并通过丙氨酸扫描,确定了其中一个表位上三个关键的氨基酸位点,为Gly m Bd 28K抗原图谱的绘制以及低过敏食品的开发提供了理论数据。主要研究内容如下:1.利用Gly m Bd 28K天然蛋白对小鼠进行四次免疫,根据抗体血清效价和敏感性,选取2号小鼠加强免疫后取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合。采用间接ELISA法筛选出阳性孔后进行三次有限稀释亚克隆,最终得到两株能够稳定分泌Gly m Bd 28K单克隆抗体的细胞株1E3和2F4。采用体外诱生腹水法大量制备单克隆抗体,得到两株单克隆抗体mAb1E3和mAb2F4并纯化,经测定其亚型均为IgG1型。免疫学特性测定结果表明,杂交瘤细胞1E3和2F4细胞上清效价分别为1:1.28×10³和1:6.40×10²,腹水效价分别为1:4.10×10⁵和1:2.05×10⁵;mAb1E3和mAb2F4的IC50分别为23.99 ng/mL和95.50 ng/m L;亲和力常数分别为2.62×109 L/mol和2.86×10⁹L/mol;mAb1E3与花生蛋白、芝麻蛋白、核桃蛋白和小麦麦谷蛋白的交叉反应率均低于0.1%。2.利用SWISS-MODEL在Gly m Bd 28K同源蛋白的三级结构基础上建立了Gly m Bd 28K的三级结构模型,并通过DeepView 4.1软件对该模型的稳定性进行了评估。分别利用DNAStar、SOPMA、BepiPred和ABCpred预测Gly m Bd 28K的线性B细胞表位,综合预测结果,5个最有可能的抗原表位分别为²⁶EGGDKKSP33、⁹⁶RGE⁹⁸、¹⁴⁶DPST¹⁴⁹、¹⁶³GGAN¹⁶⁶和²²²KDD²²⁴。在Gly m Bd 28K三级结构模型的基础上,利用DiscoTope 2.0预测出了6个与构象表位相关的区段³²SPKS³⁵,⁶¹GR⁶²,⁶⁴F,¹³⁵EG¹³⁶,²⁰⁶DDSHAPSL²¹³,²¹⁵ TKFLQLKKDDKEQQ²²⁸。3.利用DNAStar等生物信息学软件分析Gly m Bd 28K蛋白的一级结构、二级结构,以及Gly m Bd 28K蛋白的亲水性、柔韧性和表面可及性等结构特性,设计合成了34条重叠多肽,覆盖Gly m Bd 28K蛋白的一级结构。合成多肽与BSA偶联后,分别与Gly m Bd 28K多克隆抗体以及抗重组蛋白的单克隆抗体（mAb2D9、mAb3F5和mAb3H6）和抗天然蛋白的单克隆抗体（mAb1E3和mAb2F4）进行Dot-blot试验,初步筛选出三条主要的阳性多肽²⁸（C）GDKKSPKSLFLMSNS⁴²（G28-S42）、⁵⁶（C）LKSHGGRIFYRHMHI70（L56-I70）、¹⁵⁴（C）ETFQSFYIGGGANSH¹⁶⁸（E154-H168）。竞争ELISA结果表明,L56-I70能够抑制mAb3F5与Gly m Bd 28K天然蛋白的结合,半数抑制浓度为60 ng/m L。丙氨酸依次取代L56-I70上的每一位氨基酸,合成突变多肽,并与mAb3F5反应,结果证明F64、Y65和R66是L56-I70上三个关键的氨基酸结合位点。