论文部分内容阅读
目的:慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于骨髓造血干细胞克隆性增殖的疾病,其分子遗传学标记为Ph+染色体。虽然酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKI)使CML患者的生存率得到明显提高,但不能完全消除白血病干细胞(Leukemia stem cells,LSCs),使患者仍存在复发的风险;另外,部分CML患者由于其他肿瘤相关的基因突变或长期服药等原因存在耐药问题。T细胞急性淋巴细胞白血病1(T cell acute lymphoblastic leukemia 1,TAL1)是正常造血过程中重要的转录因子,TAL1在造血干/祖细胞向T细胞分化过程中表达下调,最终在成熟T细胞中沉默,当在成熟T细胞中异常表达时,与急性T淋巴细胞白血病(T cell Acute lymphocytic leukemia,TALL)的发生有关。本研究基于数据库分析发现的TAL1在CML中表达异常的特点,分析CML-LSCs及IM诱导的CML细胞株中TAL1的表达情况,进一步探讨TAL1在细胞凋亡与红系分化中的作用机制,旨在了解TAL1在CML中的调控网并寻找CML治疗潜在的新靶点。方法:(1)利用GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析CML患者与健康个体(Healthy individual,HI)外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)之间TAL1的表达差异。(2)利用多色流式细胞仪分选初发的慢性期CML患者骨髓标本中LinCD34+CD38-CD26+细胞与Lin-CD34+CD38-CD26-细胞。(3)使用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术靶向下调K562、KBM5、KU812、JURKAT、TOM1与SUP-B15细胞中基因的表达。(4)利用转录组测序技术结合DAVID(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)生物信息学方法分析信号富集与相关基因的变化情况。(5)使用荧光定量PCR技术(q RT-PCR)检测经过不同处理的样品中TAL1、PTEN、lnc RNA-BGLT3、BCR-ABL、NFE2、γ-goblin、CD71与CD235A基因的变化趋势。(6)Western Blot技术检测经不同处理的样品中TAL1、PTEN、AKT以及p-AKT蛋白水平的变化情况。(7)利用流式细胞术检测某基因或药物对细胞凋亡的影响。结果:(1)GEO数据库中初发CML患者PBMCs中TAL1的表达显著低于健康人。(2)CML慢性期患者Lin-CD34+CD38-CD26+细胞中BCR-ABL融合基因呈阳性且TAL1低表达。(3)K562细胞中使用RNAi技术下调BCR-ABL融合基因或IM处理均可以上调TAL1的表达。(4)K562细胞中抑制TAL1的表达,可以显著抑制IM诱导的细胞凋亡及AKT磷酸化水平下降。(5)K562细胞中IM同样可以上调PTEN与lnc RNA-BGLT3的表达。(6)K562与KU812细胞中下调TAL1的表达会抑制PTEN与lnc RNA-BGLT3的表达;K562细胞中过表达TAL1则会上调PTEN与lnc RNA-BGLT3的表达。(7)K562细胞中抑制PTEN或lnc RNA-BGLT3的表达,均可以抑制IM诱导的细胞凋亡。(8)K562细胞中靶向抑制AKT的表达或PI3K-AKT通路抑制剂均可以促进IM诱导的细胞凋亡。(9)与CML中不同的是,ALL细胞中抑制TAL1的表达时反而上调PTEN与lnc RNA-BGLT3的表达,而TAL1过表达时却抑制PTEN与lnc RNA-BGLT3的表达。(10)诱导脐带血CD34+细胞(cord blood-CD34+cells,CB-CD34+)发生红系分化过程中,TAL1、PTEN以及lnc RNA-BGLT3的表达上调。(11)低浓度IM可以上调K562细胞中NFE2、CD71、CD235A以及γ-goblin在m RNA水平的表达。(12)CB-CD34+细胞中下调TAL1或lnc RNA-BGLT3的表达并诱导向红系分化6 d,可显著抑制红系标记基因CD71与γ-goblin的上升趋势,但对CD235A的影响不明显。(13)K562细胞中下调TAL1或lnc RNA-BGLT3的表达,显著抑制IM诱导NFE2、CD71、CD235A以及γ-goblin的上升趋势。结论:本研究首次发现TAL1在CML-LSCs中低表达并受BCR-ABL融合基因抑制;下调TAL1抑制PTEN的表达,从而激活PI3K-AKT通路,最终抑制IM诱导的CML细胞凋亡;PTEN与lnc RNA-BGLT3是TAL1的潜在靶基因;抑制PI3K-AKT通路,可以增加CML细胞对IM的敏感度;下调TAL1或lnc RNA-BGLT3的表达会抑制CB-CD34+细胞与K562细胞的红细胞分化进程。这些结果揭示了TAL1在CML中的重要作用,并证实TAL1直接或间接通过PTEN调控PI3K-AKT信号通路,影响TKI诱导的CML细胞凋亡,这可能是CML治疗和发病的新机制,为解决CML耐药问题提供新思路。