肺癌是世界上最常见的肿瘤,死亡率最高。80%以上的肺癌患者被诊断为非小细胞肺癌（NSCLC）。非小细胞肺癌有两种主要亚型:肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）。不同亚型的NSCLC与不同的分子生物学特性有关,两种亚型NSCLC的分子机制不同,导致治疗方案和临床疗效存在明显差异。因此,深入分析LUSC与LUAD之间的差异基因,有助于寻找鉴别和治疗LUSC与LUAD的信号通路和分子诊断标志物。外泌体在肿瘤中发挥着不同作用,如免疫调节、转移前龛的形成、肿瘤生长、治疗耐药的调节、以及外泌体可介导药物排出。由于外泌体与原始细胞状态密切相关,在体液循环中相对稳定,易于从患者体内采集,因此,外泌体是肿瘤诊断、预后和治疗的理想生物标志物。然而迄今为止,目前尚不清楚NSCLC患者外泌体中是否存在理想的分子诊断标志物来区分LUSC和LUAD。因此,我们进行了本项研究,其研究目的是确定患者血浆外泌体中携带的m RNA是否能有效的区分LUSC和LUAD患者。本研究利用肿瘤基因组图谱（Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析了LUSC和LUAD的差异表达基因。并利用生物信息学方法鉴定这些m RNA是区分LUSC和LUAD的潜在分子诊断标记。同时收集16例LUSC和54例LUAD患者的外周血,分离鉴定血浆外泌体,并验证上述差异表达的m RNA可用来区分LUSC和LUAD,及其与临床生物学指标之间的关系。并通过多种体外实验分析上述差异表达的基因的生物学功能,以期阐明其在肺癌的发生发展中可能的作用机制,为后续研究外泌体在肺癌中的作用机制提供实验基础。主要研究内容和结果如下:第一部分利用TCGA数据库筛选肺鳞癌和肺腺癌差异表达基因目的:本部分旨在分析肿瘤基因组图谱（Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中LUSC和LUAD的差异表达基因,以期寻找区分LUSC和LUAD的潜在分子诊断标记物。方法:1.利用TCGA数据库筛选LUSC和LUAD的差异表达基因。2.对LUSC和LUAD中的差异表达的基因进行GO分析和KEGG pathway分析。3.根据筛选出的差异表达的基因,挑选关键基因,对其表达与肺癌患者的临床特征和预后进行分析。结果:1.LUSC和LUAD患者共有1619个基因表达差异。最终本研究从LUSC和LUAD组中筛选出17个TPM>1000的差异表达的基因。其中有8个基因（S100A9、TP63、SFN、KRT17、KRT5、KRT6A、HSPB1和KAT19）在LUSC中表达升高而在LUAD中表达降低;17个DEGs中有9个基因（MT-ND6、CD74、HLA-DRB1、HLA-DRA、CEACAM6、SLC34A2、SFTPB、SFTPA1和SFTPA2）在LUAD中表达升高而在LUSC中表达降低。2.DEGs在LUAD中主要涉及多种生物学过程,如补体激活调节、信号模式识别受体活性、模式识别受体信号途径、上皮向间充质转化的负调控;在LUSC中主要涉及多种生物学过程,如细胞分裂、有丝分裂核分裂、有丝分裂细胞周期G1/S转换、有丝分裂姐妹染色单体分离等。3.LUAD中富集度最高的三种信号通路是补体和凝血级联、金黄色葡萄球菌感染和细胞粘附分子。然而,在LUSC中富集程度最高的三种信号途径是细胞周期、p53信号通路和肿瘤发生发展过程。4.TP63 m RNA与LUSC患者的临床分期、T分期、淋巴结转移和远处转移均无相关性（P>0.05）;KRT5 m RNA与LUSC患者的临床分期、T分期、淋巴结转移和远处转移均无相关性（P>0.05）;CEACAM6 m RNA与LUAD患者的临床分期、T分期、淋巴结转移和远处转移均无相关性（P>0.05）;SFTPB m RNA与LUAD患者的临床分期、T分期、和远处转移均无相关性（P>0.05）,但与和淋巴结转移（P<0.05）呈正相关。5.TP63高表达时,LUAD患者的生存率虽降低,但差异并无统计学意义（P>0.05）;TP63低表达时,LUSC患者的生存率显著降低（P<0.01）。KRT5高表达时,LUAD患者的生存率虽然降低,但差异并无统计学意义（P>0.05）;KRT5低表达时,LUSC患者的生存率显著降低（P<0.05）。CEACAM6低表达时,LUAD患者的生存率虽然降低,但差异并无统计学意义（P>0.05）;CEACAM6高表达时,LUSC患者的生存率显著降低（P<0.01）。SFTPB高表达时,LUAD患者的生存率显著降低（P<0.01）;SFTPB高表达时,LUSC患者的生存率显著降低（P<0.05）。小结:1.从LUSC和LUAD组中筛选出17个TPM>1000的差异表达的基因。其中17个DEGs中有8个基因在LUSC中表达升高而在LUAD中表达降低;17个DEGs中有9个基因在LUAD中表达升高而在LUSC中表达降低。2.利用生物信息学方法对差异基因进行GO分析和KEGG分析,不同组织学类型的肺癌中差异基因不同,其富集的信号通路也有所差异。3.TP63和KRT5在LUSC中表达升高,而在LUAD中表达下降;CEACAM6和SFTPB在LUAD中表达升高,而在LUSC中表达下降。4.SFTPB m RNA的表达与LUAD患者淋巴结转移呈正相关,而与其他临床特征无关性。CEACAM6 m RNA的表达与LUAD患者的临床特征无关性。TP63 m RNA和KRT5 m RNA与LUSC患者的临床特征无关性。5.SFTPB可预测LUAD和LUSC患者的预后;TP63、KRT5、和CEACAM6均可预测LUSC患者的预后。第二部分TCGA筛选的肺鳞癌和肺腺癌的差异基因在外泌体中的验证目的:旨在明确TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB在外泌体中的表达以及其是否可用于鉴别LUSC和LUAD。方法:利用超高速离心法提取16例肺鳞状细胞癌血液和54例肺腺癌血液中的外泌体,并通过透射电镜、Western blotting和NTA对血浆中提取的外泌体进行分析鉴定。采用检测外泌体中TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB m RNA的表达水平,并利用单独或联合上述差异基因对肺鳞癌和肺腺癌进行临床诊断性能评价。结果:1.通过透射电镜、Western blotting和NTA对血浆中提取的外泌体进行分析,结果表明外泌体被成功提取。2.以ACTB和SLC25A为内参照,LUSC患者外泌体中TP63和KRT5m RNA表达水平均显著升高（P<0.01）,而LUAD患者外泌体中CEACAM6和SFTPB m RNA表达水平均显著升高（P<0.01,P<0.05）。3.以ACTB为内参照基因,外泌体来源的TP63的AUC为0.682（95%CI:0.526-0.837）,敏感性和特异性分别为74.1.0%和62.5%。外泌体来源的KRT5的AUC为0.683（95%CI:0.525-0.842）,敏感性和特异性分别为79.6%和62.5%。外泌体来源的CEACAM6的AUC为0.681（95%CI:0.547-0.814）,敏感性和特异性分别为87.5%和53.7%。外泌体来源的SFTPB的AUC为0.686（95%CI:0.533-0.838）,敏感性和特异性分别为43.7%和90.7%。TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB联合后的AUC为0.757（95%CI:0.625-0.889）,敏感性为75.0%,特异性为72.2%,优于以上单个基因的任何一种。以SLC25A为内参照基因,外泌体来源的TP63的AUC为0.716（95%CI:0.560-0.872）,敏感性和特异性分别为61.1%和75.0%。外泌体来源的KRT5的AUC为0.715（95%CI:0.586-0.844）,敏感性和特异性分别为81.3%和66.7%。外泌体来源的CEACAM6的AUC为0.730（95%CI:0.592-0.869）,敏感性和特异性分别为81.3%和66.7%。外泌体来源的SFTPB的AUC为0.701（95%CI:0.548-0.855）,敏感性和特异性分别为50.0%和87.0%。TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB联合后的AUC为0.822（95%CI:0.699-0.945）,灵敏度为62.5%,特异性为88.89%,优于以上单个基因的任何一种。小结:1.非小细胞肺癌患者血浆中外泌体来源的TP63和KRT5在LUSC中表达上升而在LUAD表达下降。2.非小细胞肺癌患者血浆中外泌体来源的CEACAM6和SFTPB在LUAD中表达上升而在LUSC表达下降。3.基于ACTB的4个外泌体m RNAs诊断NSCLC的AUC分别为0.682、0.683、0.681和0.686。基于ACTB作为内参照,TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB联合应用的AUC、敏感度和特异度,均优于任何一种单一标志物的单独应用。4.基于SLC25A的4个外泌体m RNAs诊断NSCLC的AUC分别为0.716、0.715、0.730和0.701。基于SLC25A作为内参照,TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB联合应用的AUC、敏感度和特异度,均优于任何一种单一标志物的单独应用。第三部分TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB在非小细胞肺癌细胞中的表达及对其生物学行为的影响目的:探讨TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB在非小细胞肺癌细胞中的表达及其对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。方法:采用q RT-PCR法检测TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB在非小细胞肺癌细胞中的表达。采用CCK-8实验、划痕愈合实验以及流式细胞术检测过表达或敲低TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和凋亡能力的影响。结果:1.q RT-PCR结果显示,与H1299细胞相比,H1975细胞中TP63和KRT5 m RNA的表达升高;与H1975细胞相比,H1299细胞中CEACAM6和SFTPB m RNA的表达升高。2.CCK-8实验结果显示,过表达TP63能抑制H1299细胞的增殖能力（P<0.05）,而过表达KRT5能促进H1299细胞的增殖能力（P<0.05）;过表达CEACAM6能促进H1975细胞的增殖能力（P<0.05）,过表达SFTPB能抑制H1975细胞的增殖能力（P<0.05）;敲低TP63能促进H1975细胞的增殖能力（P<0.05）;敲低KRT5能抑制H1975细胞的增殖能力（P<0.05）;敲低CEACAM6能抑制H1299细胞的增殖能力（P<0.05）;敲低SFTPB能促进H1299细胞的增殖能力（P<0.05）。3.划痕愈合实验结果显示,过表达TP63抑制H1299细胞的体外迁移能力（P<0.05）,过表达KRT5促进H1299细胞的体外迁移能力（P<0.05）;过表达CEACAM6可一定程度上促进H1975细胞的体外迁移能力,但差异无统计学意义（P>0.05）,过表达SFTPB抑制H1975细胞的体外迁移能力（P<0.05）;敲低TP63能促进H1975细胞的体外迁移能力（P<0.05）,敲低KRT5能抑制H1975细胞的体外迁移能力（P<0.05）;敲低CEACAM6能抑制H1299细胞的体外迁移能力（P<0.05）,敲低SFTPB能促进H1299细胞的体外迁移能力（P<0.05）。4.流式细胞术结果显示,过表达TP63能促进H1299细胞的凋亡能力（P<0.05）,而过表达KRT5能抑制H1299细胞的凋亡能力（P<0.05）;过表达CEACAM6能抑制H1975细胞的凋亡能力（P<0.05）,过表达SFTPB能促进H1975细胞的凋亡能力（P<0.05）;敲低TP63能抑制H1975细胞的凋亡能力（P<0.05）;敲低KRT5能促进H1975细胞的凋亡能力（P<0.05）;敲低CEACAM6能促进H1299细胞的凋亡能力（P<0.05）;敲低SFTPB能抑制H1299细胞的凋亡能力（P<0.05）。小结:1.TP63和KRT5 m RNA在肺鳞癌细胞系H1975中高表达,而在肺腺癌细胞系H1299中低表达。2.CEACAM6和SFTPB m RNA在肺腺癌细胞系H1299中高表达,而在肺鳞癌细胞系H1975中低表达。3.在TP63相对低表达的H1299细胞中过表达TP63能抑制H1299细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡;在KRT5相对低表达的H1299细胞中过表达KRT5能促进H1299细胞的增殖和迁移能力,抑制细胞凋亡;在TP63相对高表达的H1975细胞中敲低TP63能促进H1975细胞的增殖和迁移能力,抑制细胞凋亡;在KRT5相对高表达的H1975细胞中敲低KRT5能抑制H1975细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡。4.在CEACAM6相对低表达的H1975细胞中过表达CEACAM6能促进H1975细胞的增殖能力,抑制细胞凋亡;在CEACAM6相对低表达的H1975细胞中过表达CEACAM6能抑制H1975细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡;在CEACAM6相对高表达的H1299细胞中敲低CEACAM6能抑制H1299细胞的增殖和迁移能力,抑制细胞凋亡;在SFTPB相对高表达的H1299细胞中敲低SFTPB能促进H 1299细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡。结论:1.来源于外泌体的TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB m RNA可能是区分LUAD和LUSC的潜在血液生物标志物。多种生物标志物联合应用可提高不同肺癌亚型诊断的特异性和敏感性。2.TP63、KRT5、CEACAM6和SFTPB影响肺癌细胞的增殖、迁移和凋亡能力。