【摘 要】
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自噬是细胞内一种重要的代谢途径,其通过依赖溶酶体降解或消化细胞内受损的器官和蛋白或入侵微生物来获取再生的能量。根据细胞物质运输到溶酶体内的途径不同,自噬分为:巨自
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自噬是细胞内一种重要的代谢途径,其通过依赖溶酶体降解或消化细胞内受损的器官和蛋白或入侵微生物来获取再生的能量。根据细胞物质运输到溶酶体内的途径不同,自噬分为:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬也就是平时我们所说的自噬,也是研究最多的,它多由变性的线粒体诱导产生,结构体比较大。细胞在应激状态会启动自噬,如低氧饥饿等,启动自噬可以补充细胞所需的营养是其生存的重要手段。自噬可以导致细胞凋亡和自噬性细胞死亡,但是自噬和营养缺乏以及细胞死亡的关系不明确。为了探索自噬在小鼠肿瘤细胞中对抗营养缺乏的分子途径,我们设计以下实验:用正常的小鼠AML-12细胞和Hepa1-6细胞分别在无血清条件下培养并与对照组比较,观察各细胞死亡率情况。在不同条件下提取两种细胞的RNA和蛋白,检测自噬相关基因ATG5的RNA和蛋白水平的表达。用各种靶基因的si-RNAs转染到细胞来沉默ATG5基因的表达,探讨自噬基因ATG5与小鼠细胞缺血情况下细胞生长的相关性。为了检测自噬蛋白ATG5对小鼠肝癌细胞对缺血的不敏感是否和细胞周期相关,转染了外源ATG5表达的质粒后,RT-qPCR和western blot分析细胞周期的抑制蛋白p21(cip1/waf1)的表达。并用流式细胞仪检测缺血后细胞周期。而后用si-rna沉默内源的p21(cip1/waf1),检测p21(cip1/waf1)蛋白表达和细胞死亡情况。从而探讨自噬基因ATG5在小鼠肝癌细胞中对抗营养缺乏的分子途径。在营养缺乏的环境下,和小鼠正常的肝细胞AML-12相比,肝癌细胞Hepa1-6死亡率较低,说明其对缺血引发的细胞死亡有抵抗性。缺血使AML-12和Hepa1-6细胞内诱导的自噬相关蛋白ATG5的表达升高,但肝癌细胞Hepa1-6中自噬相关蛋白ATG5的表达升高明显(p<0.05);沉默其内源的自噬相关基因ATG5将导致Hepa1-6细胞对缺血的敏感性升高即细胞死亡增加。说明自噬相关基因ATG5在Hepa1-6中可能和细胞死亡抗性有关。在转染了外源基因ATG5表达的质粒后,Hepa1-6肝癌细胞的ATG5可以诱导细胞周期抑制蛋白p21(cip1/waf1)导致细胞滞留在G1期,可能是癌细胞对缺血的不敏感的分子机理。本研究阐明了小鼠肝癌细胞通过升高自噬蛋白ATG5来对抗生存环境中营养缺乏的危机。而且,ATG5是通过提高细胞内细胞周期的抑制蛋白p21(cip1/waf1)的表达量,从而导致细胞滞留在G1期以逃避缺血带来的细胞死亡危机。
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