【摘 要】
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全球食品中的真菌毒素污染正在威胁着人类的健康安全,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxins B1,AFB1）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是最为常见的两种真菌毒素,会引发肝癌、生长迟缓、生殖系统损坏等多种疾病。尽管目前对于以上两种真菌毒素的降解方法多样,但对这两种真菌毒素同时降解的生物法研究较少。而由于谷物中AFB1和ZEN污染的普遍性,亟需一种能够温和、高效实现两种毒素同时降解
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全球食品中的真菌毒素污染正在威胁着人类的健康安全,其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxins B1,AFB1）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是最为常见的两种真菌毒素,会引发肝癌、生长迟缓、生殖系统损坏等多种疾病。尽管目前对于以上两种真菌毒素的降解方法多样,但对这两种真菌毒素同时降解的生物法研究较少。而由于谷物中AFB1和ZEN污染的普遍性,亟需一种能够温和、高效实现两种毒素同时降解的方法。玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1由ZHD101突变得到,优化前对ZEN的降解率为42.91%;锰过氧化物酶Phc Mnp能通过破坏AFB1呋喃环上的8,9位双键实现脱毒,优化前降解率为50.52%。上述两种酶都在食品级酵母乳酸克鲁维（Kluyveromyces lactis）中实现了分泌表达。因此,本文利用连接肽（GGGGS）n（n=1～4）构建了ZHD101.1和Phc Mnp的融合酶,在乳酸克鲁维酵母中实现融合酶的表达。并对重组菌诱导表达融合酶的条件和重组酵母菌的发酵上清液对两种毒素的降解条件进行了优化。具体研究如下:1、本研究尝试利用多个单位的柔性连接肽（GGGGS）n（n=1～4）连接玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1和锰过氧化物酶Phc Mnp以构建融合酶ZPFn,成功得到了以一个单位GGGGS构建的融合酶ZPF1,并构建了食品级乳酸克鲁维酵母重组酵母菌株GG799（p KLAC1-ZPF1）。进行诱导表达后发现其发酵上清液可以降解AFB1和ZEN,降解率分别为46.46%和35.38%。2、对重组酵母菌GG799（pKLAC1-ZPF1）的诱导表达条件进行优化,最优条件为:25℃下诱导72 h,培养基中含40.0 g/L半乳糖、0.5 mmol/L Mn SO4和0.2 mmol/L hemin。3、研究了在两种反应体系中融合酶ZPF1对AFB1和ZEN降解效率,并优化了反应条件。（1）反应体系1（PhcMnp反应体系）中的最优降解反应条件为:将含有0.2 mmol/L Mn SO4、1.0 mmol/L H2O2和2.0 mg/m L发酵液蛋白的丙二酸（p H 4.0）缓冲液在40℃下反应8 h。优化后ZPF1对AFB1和ZEN的降解率分别为64.11±2.93%和46.21±3.17%,分别提高了17.65%、7.45%。（2）反应体系2（ZHD101.1反应体系）中融合酶ZPF1对AFB1没有降解作用,对ZEN的最优降解反应条件为:将含有2.0 mg/m L发酵液蛋白的Tris-HCl（p H 7.5）缓冲液在40℃下反应30 min,降解率为41.45±2.24%,提高了6.07%。4、为制备大量重组酵母菌菌剂,对重组酵母菌GG799（pKLAC1-ZPF1）培养基的成分和培养条件进行优化以提高生物量。优化后的最优培养基为:葡萄糖20.409 g/L、蛋白胨30.455 g/L、酵母浸粉24.725 g/L、KH2PO4 4.477 g/L、Mg SO4 0.646 g/L;最优培养条件为:26℃、220 rpm、初始p H 4.5。在上述条件下,用5 L发酵罐进行高密度扩大培养,其生物量为34.05±3.34 g/L,是普通摇瓶发酵的3.95倍。5、对重组酵母菌菌剂的制备工艺条件（离心条件、保护剂比例、干燥方式、储存方式）进行了优化,最优制备工艺为:发酵结束后在6000 rpm下离心15 min收集菌体,选择保护剂与湿菌体的比例为3:1的喷雾干燥法,并将菌剂置于-20℃下储存得到的菌活最高。储存三个月后复性得到的重组酵母菌发酵上清液,在反应体系1中对AFB1和ZEN的降解率为48.18±3.23%和34.83±2.82%;在反应体系2中对ZEN的降解率为30.1±2.73%。
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