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背景:肺癌为当前世界各地最常见的恶性肿瘤之一,是一种严重威胁人类健康的疾病,随着肺癌发病率和死亡率的不断升高,肺癌越来越引起广大研究者的关注。化疗仍然是肺癌治疗的常用方法,因此,探寻与研究肺癌化疗敏感性相关基因是一项迫在眉睫的任务,藉此提高肺癌患者生存率,改善预后。随着人类基因组计划的完成及分子生物学的发展,人们在基因水平上对肿瘤的发生发展的认识取得了很大的成就,但离攻克癌症仍然有很远的路要走。PEBP4属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的成员,不仅参与MAPK信号通路的抑制作用,还参与JNK通路的抑制,促进AKT的激活,近年来研究数据表明PEBP4蛋白的过表达与多种肿瘤的发生发展以及浸润转移密切相关。PEBP4在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌细胞和组织中的表达均高于其在正常对照组中的表达,在肿瘤组织中高表达的 PEBP4 可能使肿瘤细胞对 TNF-α(tumor necrosis factor-α)or TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)引起的凋亡起抵抗作用。但有关 PEBP4是否在肺鳞状细胞癌中表达以及与肺鳞状细胞癌发生发展关系的研究仍未见相关报道。本课题研究了 PEBP4的表达与肺非小细胞癌的临床病理的相关性以及PEBP4在非小细胞肺癌发生发展和侵袭转移中的作用,非小细胞肺癌的早期诊断和肿瘤靶向治疗提供实验依据。第一部分PEBP4蛋白在肺非小细胞癌组织中的表达及其意义目的:本研究旨在探讨PEBP4蛋白在肺鳞状细胞癌组织中的表达及其与肺鳞状细胞癌临床病理的相关性。方法:采用免疫组织化学方法检测61例肺鳞状细胞癌组织及其癌旁正常组织中PEBP4蛋白的表达,计算其阳性率;并Western blot方法检测肺鳞状细胞癌组织及其癌旁正常组织中PEBP4蛋白的表达变化,用RT-PCR和Western blot方法检测淋巴结转移阳性和阴性患者癌组织中mRNA和蛋白表达情况。结果:PEBP4蛋白在肺鳞状细胞癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织(p<0.05);PEBP4 mRNA在淋巴结转移阳性患者癌组织中的表达量显著高于淋巴结转移阴性患者(p<0.05),PEBP4蛋白的表达也显著高于淋巴结转移阴性患者(p<0.05),;PEBP4蛋白在早期(Ⅰ，Ⅱ)患者中的表达显著低于中晚期(Ⅲ，Ⅳ)患者(p<0.05),且随着肺鳞状细胞癌组织分化程度降低,PEBP4蛋白的表达越高(p<0.05),但与患者的性别、年龄、肿瘤的大小等无关(p<0.05)。结论:PEBP4蛋白的高表达可能与肺鳞状细胞癌的发生及侵袭转移有关。第二部分PEBP4基因表达与非小细胞肺癌侵袭转移之间的关系目的:探讨PEBP4基因对于非小细胞肺癌细胞生长、增殖、凋亡及浸润转移等生物学行为的影响,为将来人非小细胞肺癌的生物治疗提供实验依据。方法:采用Western blot方法检测非小细胞肺癌细胞系(HCC827,A549,NCI-H661,NCI-H292 and 95-D)中PEBP4蛋白的表达情况,再用siRNA干扰技术下调HCC827细胞中PEBP4表达,观察HCC827细胞侵袭能力。用PEBP4-siRNA干扰表达载体转染人HCC827细胞,检测相关生物学行为。结果:PEBP4 在肺癌细胞系(HCC827,A549,NCI-H661,NCI-H292 and 95-D)中的高表达,在正常支气管细胞中呈低表达。PEBP4干扰组HCC827细胞的活力、增殖能力以及迁移能力明显低于阴性对照组和空白对照组HCC827细胞(p<0.05),PEBP4干扰组发生凋亡的HCC827细胞所占比例明显高于阴性对照组和空白对照组(p<0.05),PEBP4 干扰组 HCC827 细胞中 CyclinD1、Bcl-2、MMP-2 及 MMP-9 蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(p<0.05),p53蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(p<0.05)。结论:PEBP4基因可能具有促进HCC827细胞生长增殖及其侵袭迁移能力,抑制HCC827细胞凋亡的作用,PEBP4基因的表达下调可能与人非小细胞肺癌HCC827细胞迁移能力下降、凋亡能力增加有关。第三部分PEBP4的异位表达对顺铂诱导的细胞毒性之间的关系目的:检测肺癌细胞系A549中PEBP4的异位表达对顺铂诱导的细胞毒性之间的关系,并探讨其相关作用机制。为将来PEBP4在人肺癌的化疗中应用提供实验依据。方法:构建pcDNA3-PEBP4重组质粒,将pcDNA3-PEBP4重组质粒和PEBP4 shRNA转染肺癌细胞A549,Western Blot检测各组A549细胞中PEBP4的表达。MTT分别检测pcDNA3-PEBP4重组质粒和PEBP4 targeting shRNA转染的A549细胞,在顺铂(DDP)作用48小时后,各组A549细胞活力的变化;利用流式细胞仪检测各组A549细胞凋亡的变化;并利用Western Blot检测各组A549细胞中p53蛋白的表达变化。应用荧光素酶报告基因系统验证PEBP4是miR-34a的靶基因。采用Westemblot方法检测miR-34a对A549细胞中PEBP4蛋白表达的影响。结果:成功构建了 pcDNA3-PEBP4重组表达质粒。pcDNA3-PEBP4重组质粒和PEBP4 targeting shRNA 转染 A549 细胞后,Western Blot 结果显示:pcDNA3-PEBP4 转染组PEBP4蛋白的表达显著高于正常对照组和PEBP4 shRNA转染对照组(p<0.05);PEBP4 targetingshRNA转染组,PEBP4蛋白的表达显著下降(p<0.05)。DDP作用48h后,MTT结果显示:DDP加药组的A549细胞活力显著低于正常对照组(p<0.05);pcDNA3-PEBP4转染组A549细胞活力低于正常对照组(p<0.05),却高于DDP加药组和PEBP4 shRNA转染组(p<0.05);PEBP4 shRNA转染组细胞活力则显著低于正常对照组p<0.05)和DDP加药组(p<0.05)。流式细胞仪检测结果和Western Blot结果显示:DDP加药组的凋亡细胞数和p53蛋白的表达水平显著高于正常对照组(p<0.05);pcDNA3-PEBP4转染组凋亡细胞数和p53的表达水平高于正常对照组(p<0.055),却低于 DDP 加药组和 PEBP4 shRNA 转染组(p<0.05);PEBP4 shRNA转染组凋亡细胞数和p53的表达水平则显著高于正常对照组(p<0.05)和DDP加药组(p<0.05)。荧光素酶报告基因系统检测结果显示:与对照组相比,转染miR-34a mimic组的相对荧光素酶活力显著降低(p<0.05)。Western blot检测结果显示:与对照组相比,在A549细胞中转染miR-34amimic48h后,细胞中PEBP4蛋白的表达显著下降(p<0.01)。结论:PEBP4的过表达降低A549细胞对DDP诱导的细胞毒性的敏感性,这一过程主要通过影响p53蛋白的表达或受到miR-34a的调节来达到。