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目的：甲状腺细胞可以产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS是合成甲状腺激素的必需物质。但当ROS产生过多时,就会产生毒性,对细胞结构和大分子物质造成损伤。研究发现给碘缺乏的实验动物补碘会产生毒性作用,碘诱导甲状腺复原的大鼠的甲状腺中氧化应激显著增强,导致甲状腺细胞破坏和炎症反应。甲状腺中存在多种抗氧化剂,包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物、过氧化物氧化还原蛋白(peroxiredoxins,PRDXs)、硫氧化蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和维生素E(VE)等,VE作为抗氧化剂可以清除自由基,中断脂质过氧化的链式反应,VE对甲状腺细胞的细胞膜有很强的保护作用,正常大鼠甲状腺和肝脏中VE的浓度相同,而碘缺乏大鼠甲状腺中VE浓度是肝脏中的两倍,这些提示当甲状腺中氧化应激增强后VE的表达量显著增加。
本研究中采用VE来拮抗小剂量碘诱导的甲状腺损伤。通过研究缺碘甲肿和碘诱导甲肿复原大鼠的氧化应激、抗氧化剂表达以及超微结构改变,来检测VE对碘诱导的甲状腺细胞毒性的潜在保护作用,以及最佳补充VE剂量。
方法：选择4周龄雌性Wistar大鼠,随机分为对照组(Control)、缺碘组(LI)、缺碘2倍补碘组(LI-2I)、缺碘补碘补VE组(LI-2I+25VE/50VE/100VE)。Control组饮含碘194μg/L碘水,食低碘饲料;LI组饮去离子水,食低碘饲料12周,进行低碘甲肿造模;LI-2I组在低碘甲肿造模成功后给予饮含碘470.7μg/L碘水,食低碘饲料;LI-2I+-25VE/50VE/100VE组在低碘甲肿造模成功后给予饮含碘470.7gg/L碘水,食含25倍/50倍/100倍VE的低碘饲料,于补碘4周时麻醉处死各组动物。留取大鼠甲状腺组织,HE染色观察形态学变化,透射电镜观察甲状腺细胞超微结构,免疫组化染色观察4-羟基壬烯醛(4-HNE)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、过氧化物氧化还原蛋白(PRDX5)、硫氧还蛋白还原酶-1(TrxR-1)、CD68(单核细胞和巨噬细胞浸润的标记物)表达变化。
应用SPSS17.0软件处理和分析数据。参数计量资料:以mcan±SD表示,两组比较采用独立样本t检验,方差齐同的多组比较采用单因素方差分析(ANOVA),方差不齐时使用非参数检验。
结果：
1、低碘组甲状腺存在超微结构损伤,缺碘2倍补碘组甲状腺超微结构损伤较低碘组加重,缺碘2倍补碘补VE组甲状腺超微结构损伤较单纯2倍补碘组明显减轻,50倍VE组超微结构损伤最轻。
2、与对照组比,缺碘2倍补碘组中脂质过氧损伤指标4-HNE表达量显著增加(P＜0.05);缺碘补碘25倍和50倍补充VE组中4-HNE表达量明显下降(P＜0.05),而缺碘补碘100倍补VE组中4-HNE表达量与单纯2倍补碘组没有差异;与对照组比缺碘2倍补碘组中脂质过氧损伤指标8-OHdG表达量显著增加(P＜0.05)；缺碘补碘补充VE组中8-OHdG表达量明显下降(P＜0.05)。
3、与对照组比,缺碘2倍补碘组中抗氧化酶TrxR-1表达量显著下降(P＜0.05),缺碘补碘补VE组中TrxR-1的表达量较单纯补碘组明显增多(P＜0.05)。
4、与对照组比,缺碘2倍补碘组和低碘组中PRDX5的表达量明显增高(P＜0.05),后者增高程度高于前者,缺碘后补碘补VE组中PRDX5的表达量较单纯补碘组明显下降(P＜0.05),50倍VE组PRDX5下降最明显。
5、与对照组比,低碘组和缺碘2倍补碘组中CD68染色阳性的细胞数量明显增多(P＜0.05),缺碘2倍补碘组增加更为明显,缺碘补碘补VE组中CD68染色阳性的细胞数量较单纯补碘组明显减少(P＜0.05)。
结论：
1、长期给予2倍补碘,可以诱导缺碘甲状腺复原,导致碘诱导的甲状腺细胞毒性。
2、强烈的氧化应激可能对碘诱导的甲状腺细胞毒性起到重要作用。
3、50倍VE可能是拮抗碘诱导的甲状腺细胞毒性的最佳剂量。
目的：甲状腺是自由基产生和清除十分活跃的器官,正常情况下甲状腺组织中H2O2的产生和清除处于动态平衡,但是如果甲状腺内氧化应激过强,超过生理剂量的H2O2和其它活性氧族(ROS)引起的氧化应激就会影响甲状腺细胞正常生理功能。研究发现给碘缺乏的动物补碘后,甲状腺中氧化应激增强,对甲状腺产生毒性作用,补碘并不能完全逆转甲状腺缺碘时的形态学改变,补碘后甲状腺相对重量未恢复正常,甲状腺由于缺碘造成的超微结构损伤在补碘后不但没有减轻,反而随着补碘剂量的增加而加重。有研究发现缺碘大鼠补碘同时给予补充抗氧化剂--硒或维生素E(VE),可以部分拮抗碘诱导的甲状腺细胞毒性。TSH受体(TSHR)主要调节甲状腺的分化和功能,下游调控元件拮抗剂调节子(downstream regulatoryelement antagonistic modulator,DREAM)可以调节TSHR活性,过表达DREAM的转基因鼠的甲状腺显著肿大。
本课题拟建立Wistar大鼠缺碘甲状腺肿模型,模拟前期流行病学研究中人群的碘营养状态,给予缺碘大鼠1倍、3倍和6倍补碘,并且在补碘同时给予补充硒或VE,观察不同剂量补碘同时加/不加抗氧化剂对缺碘甲状腺复原的影响,并对两种抗氧化剂的效果进行比较,探求一条更为合理的补碘方案,为防止碘缺乏病提供新思路;同时对甲状腺形态学未能完全复原的机制进行探讨。
方法：
4周龄雌性Wistar大鼠,随机分为对照组(Control)、缺碘组(LI)、缺碘补碘组(LI-1I/3I/6I)、缺碘补碘5倍补Se组(LI-1I/3I/6I+5Se)、缺碘补碘50倍补VE组(LI-1I/3I/6I+50VE)、缺碘1倍补碘补L-T4组(LI-1I+T4)和缺碘补L-T4组(LI-T4)。Control组饮含碘194μg/L碘水,食低碘饲料;LI组饮去离子水,食低碘饲料16周,进行低碘甲肿造模;LI-1I/3I/6I组在低碘甲肿造模成功后给予饮含碘194μg/L、748μg/L、1578μg/L碘水,食低碘饲料;LI-1I/3I/6I+5Se组在低碘甲肿造模成功后分别给予饮含碘194μg/L、748μg/L、1578μg/L,含硒940μg/L的水,食低碘饲料,LI-II/31/6I+50VE组在低碘甲肿造模成功后给予饮含碘194μg/L、748μg/L、1578μg/L的水,食含50倍VE的低碘饲料,LI-1I+T4组在低碘甲肿造模成功后给予饮含碘194μg/L的水,每日皮下注射L-T4(1.0μg/100g体重),LI-T4组在低碘甲肿造模成功后给予每日皮下注射L-T4(1.0μg/100g体重),食低碘饲料。分别于补碘1周和10周时麻醉处死各组动物。称量大鼠体重和甲状腺重量,观察甲状腺相对重量变化;电感耦合等离子体质谱仪检测血清硒水平;留取大鼠甲状腺组织HE染色观察形态学变化;透射电镜观察甲状腺细胞超微结构:免疫组化染色观察4-羟基壬烯醛(4-HNE)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和CD68表达变化;Western blot检测过氧化物氧化还原蛋白5(PRDX5)、硫氧化蛋白还原酶-1(TrxR-1)、DREAM、PCNA;组织匀浆检测谷胱甘肽过氧化物(Gpx)活性。
应用SPSS17.0软件处理和分析数据。参数计量资料:以mean±SD表示,两组比较采用独立样本t检验,方差齐同的多组比较采用单因素方差分析(ANOVA),方差不齐时使用非参数检验。
结果：
1、补硒后,各补碘补硒组大鼠血硒浓度明显升高,在补硒各时点均显著高于相应补碘组及对照组(P＜0.05)。
2、与对照组和缺碘组比单纯补碘组中各时点4-HNE和8-OHdG表达量均显著增加(P＜0.05);补碘10周时,补碘补硒组和补碘补VE组中4-HNE和8-OHdG的表达量均较单纯补碘组明显下降(P＜0.05),补碘1周时,补碘补VE组中4-HNE的表达量少于补碘补硒组。
3、补碘10周时,与对照组比,缺碘补碘组中抗氧化酶TrxR-1表达量显著下降(P＜0.05),补碘补硒组和补碘补VE组中TrxR-1的表达量较单纯补碘组明显增多(P＜0.05);与对照组比,缺碘补碘组和缺碘组中各时点PRDX5的表达量明显增高(P＜0.05),后者增高程度高于前者,补碘10周时,补碘补硒组和补碘补VE组中PRDX5的表达量较单纯补碘组明显下降(P＜0.05);补碘10周时,各补硒组甲状腺中Gpx的活性显著高于单纯补碘组(P＜0.05)。
4、与对照组比,低碘组和缺碘补碘组中CD68染色阳性的细胞数量明显增多(P＜0.05),缺碘补碘补硒组和缺碘补碘补VE组中,各时点CD68染色阳性的细胞数量较单纯补碘组明显减少(P＜0.05)。
5、补碘1周和10周时,单纯补碘组、补碘补硒组和补碘补VE组以及缺碘1倍补碘补T4和缺碘补T4组中甲状腺相对重量均较缺碘组显著下降(P＜0.05),补碘第1周甲状腺相对重量快速下降,两个补T4组的甲状腺相对重量下降速度最快,之后甲状腺相对重量下降速度比较缓慢,10周,各复原组中甲状腺相对重量无差异,但都高于对照组。
6、低碘组甲状腺存在超微结构损伤,缺碘补碘组甲状腺超微结构损伤较低碘组加重,并且随着补碘剂量的增加而加重,补碘10周时的损伤程度重于补碘1周;补碘补硒组和补碘补VE组以及缺碘1倍补碘补T4和缺碘补T4组中甲状腺超微结构损伤较单纯补碘组明显减轻。
7、补碘1周时,各甲状腺复原组中DREAM的表达量显著低于缺碘组,但高于对照组组:补碘10周时,DREAM的表达量下降更为明显,与对照组比差别不显著。
8、补碘1周和10周时,缺碘组中PCNA的表达量明显高于对照组(P＜0.05),各个甲肿复原组中PCNA的表达量较低碘组明显下降,与补碘1周时比,补碘10周时PCNA的表达量进一步下降,但仍然高于对照组。
结论：
1、1倍、3倍和6倍补碘可以导致缺碘甲状腺发生碘诱导的甲状腺细胞毒性,其强度随补碘剂量的增加而增加。
2、5倍硒或50倍VE通过增加甲状腺中抗氧化酶的表达或活性来部分拮抗碘诱导的甲状腺细胞毒性,从而减轻炎症反应,促进甲状腺复原。
3、VE可以在早期拮抗补碘引起的脂质过氧化损伤,长期补充硒或VE对碘诱导的甲状腺细胞毒性的拮抗作用没有显著差异。
4、缺碘补碘同时补充5倍硒或50倍VE与甲状腺重量和相对重量的恢复无关。
5、虽然DREAM蛋白表达增多可以导致甲状腺肿大,但是补碘后甲状腺未能恢复到正常状态不是通过DREAM蛋白通路介导的。