上世纪八十年代以前,石斛药材几乎都是应用野生资源,现在市场应用以棚栽品为主。据课题组野外实地考察,野生品与棚栽品存在较大差异,野生品因多年生长,一年、二年、三年采收茎及以上（为后文作图与写作方便,以三年采收茎表示）的茎条又有明显不同。古籍有很多关于石斛性状、药用选用与功效主治的记载,但未明确石斛的药用年限。经课题组考证,唐、宋时期记载的石斛主要是指铁皮石斛或霍山石斛。因霍山石斛价格昂贵,故选用了铁皮石斛。《中国药典》中铁皮石斛的药材部位为干燥茎,未明确具体生长年限。课题组前期开展对组培和棚栽铁皮石斛的特征指纹图谱、黄酮类特征指纹图谱、水溶性与盐溶性多糖、降解多糖等研究,其中有“以广南为佳”的广西铁皮石斛的实证考察,内容包括大量的文献考证广西产的铁皮石斛为道地药材、对广西不同产地的二十多批铁皮石斛（棚栽与仿野生种植）进行了质量评价,但未对同产地不同生长年限的仿野生铁皮石斛进行研究。因此,本研究针对广西桂平的仿野生种植的铁皮石斛（一、二、三年采收茎）进行质量评价与体外活性初探,确定铁皮石斛药用年限,即对其进行“定位”研究,为铁皮石斛的开发与应用、栽培模式的选用提供一定的参考意义。目的:对本草文献进行考证,力争阐明古人药用石斛的具体部位和优良石斛的品质;分析仿野生铁皮石斛（一年、二年、三年采收茎）的质量,比较它们多糖含量、单糖组成、粗多糖分子量以及特征指纹图谱的差异;再进一步比较仿野生铁皮石斛（一年、二年、三年采收茎）粗多糖、醇提物体外抗氧化、抗肿瘤活性差异;通过以上比较,探讨一、二、三年采收的仿野生铁皮石斛的成分与活性差异,最终确定铁皮石斛的药用生长适宜年限。方法:1.利用主流本草、医术史料和地方志对石斛的药用部位、品质标准和功效进行考证。2.利用传统鉴别方法对仿野生铁皮石斛进行性状鉴别;苯酚-硫酸法检测仿野生铁皮石斛药材（一年、二年、三年采收茎）的多糖含量。3.利用HPLC法对一年、二年、三年采收的仿野生铁皮石斛的粗多糖（GPC1、GPC2、GPC3）进行单糖组成分析和对其醇提物进行特征指纹图谱比较。4.利用ELSD-UHPLC检测GPC1、GPC2、GPC3分子量。5.检测一年、二年、三年采收的仿野生铁皮石斛的粗多糖、醇提物（GPE1、GPE2、GPE3）的体外抗氧化活性(对DPPH-、OH-和Cu2+清除率)差异。6.MTT法检测仿野生铁皮石斛粗多糖与醇提物对Hela、Hep G-2、SGC7901、A540、B16肿瘤细胞增殖的影响,流式细胞仪检测、荧光染色法和q RT-PCR检测对Hela细胞凋亡的影响。7.GC-MS法分析一、二、三年采收的仿野生铁皮石斛初级代谢产物。结果:1.本草记载石斛使用部位茎,需“去根”、“去苗”和“去稍黑”;生境和产地,石斛以“生石上者”、“以广南者佳”;石斛品质以“折之有肉中实”、“石斛短而中实、木斛长而中虚”、“铁兰则色青黑、至肥泽多脂则以铁兰为佳”为好;功效有“补五脏虚劳”、“补肾”等。2.传统鉴别方法结果显示,仿野生铁皮石斛的茎与古籍记载的野生石斛的茎长相似。一、二、三年采收的仿野生铁皮石斛药材多糖百分含量分别为:51.57%、35.30%和33.51%;一、二、三年采收的仿野生铁皮石斛粗多糖的平均分子量分别是:2 148k Da、1 450 k Da和1 688 k Da;GPC1、GPC2和GPC3的甘露糖与葡萄糖峰面积比值分别为:6.48:1、7.12:1、10.80:1;初步探索三个仿野生铁皮石斛80%乙醇提取液的特征指纹图谱,结果显示图谱峰多、复杂。3.仿野生铁皮石斛的粗多糖溶液清除DPPH自由基的百分率范围为71.73%～87.01%;粗多糖对·OH-清除能力为:GPC3>GPC2>GPC1;粗多糖对铜离子还原力弱。4.粗多糖对Hela细胞的抗增殖作用总体趋势为:GPC3>GPC1>GPC2;高浓度粗多糖溶液对Hep G-2细胞作用48 h:GPC1<GPC2<GPC3,低浓度表现差异不明显;对SGC7901的抗增殖作用GPC3较GPC1、GPC2效果佳;对A549、B16细胞的活性抑制效果GPC1比GPC2、GPC3差。粗多糖溶液可诱导Hela细胞产生染色体皱缩、凋亡小体和细胞核破碎等凋亡形态特征、诱导Hela细胞凋亡和上调caspase-8、p38等m RNA。5.仿野生铁皮石斛醇提物溶液在0.5 mg/m L、1.0 mg/m L浓度水平,对·OH-的清除率均为:GPE3>GPE1>GPE2,在5.0 mg/m L浓度水平,对·OH-的清除能力为:GPE1>GPE3>GPE2;对铜离子的还原能力为:GPE1>GPE3>GPE2;相同年限不同浓度的醇提物样品对DPPH自由基的影响不大,在2.0-5.0 mg/m L浓度水平对DPPH自由基清除趋势是:GPE1>GPE3>GPE2,清除率比阳性药Vc的清除率高。6.仿野生铁皮石斛醇提物对肿瘤细胞[GPE（PBS溶,再用培养基稀释）、GPED（先加DMSO助溶,再用培养基稀释）]对Hela细胞的抑制作用为:GPE1<GPE2<GPE3;对Hep G-2细胞抗增殖影响:125-500μg/m L:GPE1、GPE2>GPE3;对SGC7901细胞的抑制影响:GPE2、GPE3较GPE1好;对A549细胞,GPE2的抑制效果较GPE1、GPE3好;对B16黑色素瘤细胞,GPE溶液在62.5-1 000μg/m L浓度水平分别作用细胞48、72 h,GPE2、GPE3溶液对B16的抑制效果比GPE1好。GPED溶液促进Hela细胞凋亡:GPED3>GPED2>GPED1,诱导Hela细胞形态改变。7.一年、二年、三年采收的仿野生铁皮石斛新鲜茎的甲醇提取物衍生化后进行GC-MS检测,与GC-MS质谱谱库进行匹对分析,结果显示GC-MS检测出仿野生铁皮石斛含单糖、氨基酸等成分134个,其中化合物个数:一年采收茎>二年采收茎>三年采收茎。结论:1.古代药用石斛使用的部位是“茎”,需“去根”、“去苗”、“去稍黑者”——弃嫩芽与年限过老的黑茎,“折之有肉而实”、“短而中实”,提示“茎”富含多糖,且野生的茎较短。2.仿野生铁皮石斛药材（一年、二年、三年采收）的茎与古籍记载的野生石斛相似;多糖含量符合《中国药典》的规定;茎粗多糖平均分子量:一年>三年>二年,粗多糖的甘露糖、葡萄糖峰面积比值随着生长年限的延长,比值越大。3.仿野生铁皮石斛的粗多糖的抗氧化活性有一定差异,实验结果显示,GPC3的抗氧化最佳;三个粗多糖溶液分别作用于Hela、Hep G-2、SGC7901、A549、B16肿瘤细胞,发现均有一定的抑制细胞生长影响,其中效果最强的是GPC3。4.仿野生铁皮石斛80%乙醇提物的抗氧化活性总趋势:GPE1>GPE3>GPE2,对肿瘤细胞Hela、Hep G-2、SGC7901、A549、B16细胞具一定的抗增殖作用。综合古代文献,以及粗多糖、醇提物的抗肿瘤、抗氧化活性,仿野生铁皮石斛一年、二年、三年采收茎均具有一定的功效,可用于日常养生,针对治疗作用,尤其辅助治疗肿瘤似以三年及以上者为好。