前言：　　 氧疗是临床上抢救新生儿呼吸衰竭最有效的方法之一,应用高体积分数氧进行机械通气治疗虽然挽救了大量新生儿的生命,但也不可避免地导致了高氧肺损伤的发生,严重者甚至发展成以肺部炎症和纤维化为主要特征的另一慢性肺部疾病一支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)。长时间吸入高浓度氧气目前被学者们认为是BPD发生的最主要原因及最危险因素。临床上高氧诱导的肺损伤仍是造成早产儿尤其是极低出生体重儿死亡或致残的主要原因之一,现已成为威胁早产儿健康和生命的首要疾病,但其具体的发病机制至今尚未完全阐明。因此,探索高氧致BPD的发生机制是国内外研究的焦点问题。　　 BPD的主要病理变化早已被证实,即是早期肺水肿,肺组织炎症反应以及晚期肺组织的纤维化。目前有关其发病机理的研究多集中在BPD晚期肺纤维化的研究,但间质纤维化一旦形成,将导致不可逆的呼吸循环障碍,威胁患儿生命。因此,探寻BPD的早期发病机制,探索疾病发展的可逆转环节,对于该病的早期诊断,早期防治尤为重要。以往的研究多着重于对肺组织炎症及氧化应激损伤机制的研究,而对肺水肿机制的研究甚少,且目前抗炎、抗氧化的早期治疗对BPD却没有取得确切的疗效。因此,本研究尝试以探索高氧肺损伤急性期—肺水肿形成机制为切入点,试图为早产儿高氧肺损伤的早期防治奠定实验基础和提供理论依据。以往研究表明肺泡上皮屏障功能异常与成人急性肺损伤密切相关,肺泡上皮细胞间紧密连接(tightjunction,TJ)是维系和调控其屏障通透性的主要结构,设想肺泡上皮细胞屏障功能异常在新生鼠高氧肺损伤急性期肺水肿的发生中也同样发挥了重要作用,那么肺水肿时,紧密连接结构是否有改变,这种改变是否影响了屏障功能,紧密连接中主要何种成分出现了变化、通过何种途径来完成呢?目前尚不清楚。　　 ZO-1(zonulaoccludensproteins-1)是紧密连接胞浆附着蛋白,在紧密连接起中介和桥梁作用,其破坏后紧密连接的功能随之变化。到目前为止还没有发现缺乏ZO-1的紧密连接;有报道称紧密连接链的形成必须有ZO-1中SH3/GUK结构域的参与;敲除TIP-1基因后,缺乏ZO-1的细胞间紧密连接形成延迟:ZO-1表达水平下降或缺失,会造成TJ结构松散甚至分解,最终影响紧密连接屏障功能的完整性。基于ZO-1的上述生理特性,在肺组织的特定表达方式及其在紧密连接的重要作用提示我们探索ZO-1在高氧肺损伤急性期肺水肿肺泡上皮细胞通透屏障中的作用。　　 本研究以高氧致新生鼠肺水肿模型和原代培养AECⅡ细胞所建立的肺上皮屏障模型为对象,采用透射电镜、Westernblotting、RT-PCR及免疫荧光等技术从组织、细胞、蛋白及核酸水平证实高氧肺损伤肺上皮ZO-1的表达变化及其作用,并应用跨膜电阻测量记录模式和单细胞层示踪剂流量测定来证明暴露于高氧中的肺上皮屏障结构和功能变化,阐明肺上皮细胞ZO-1表达异常导致肺内通透屏障受损是高氧致肺水肿的重要机制。　　 实验材料及方法：　　 一、动物模型制备　　 本实验在中国医科大学盛京医院实验动物中心完成。新生Wistar大鼠生后12h之内随机分为高氧组(实验组)和空气组(对照组)。组置于玻璃氧箱中,持续输入氧气,FIO2=0.85±0.02(美国OM-25ME型测氧仪监测)。用钠石灰吸收CO2,使其浓度＜0.5%(Dapex气体分析仪),温度22-25℃,湿度60%-70%。每天定时开箱15min,添水、饲料及更换挚料,并与空气组交换母鼠以免因氧中毒而致喂养能力下降。对照组FIO2:0.21,具体方法及实验控制因素同实验组。　　 二、标本采集和处理　　 每组分别于实验后1,3,5和7d随机选取15只称重,5%哥拉腹腔注射(0.6ml/100g)麻醉后,分离气管,打开胸腔,暴露心肺,经气管缓慢注入4%多聚甲醛,然后置于4%多聚甲醛中,4℃过夜,石蜡包埋,制作4μm组织切片,用于肺形态学观察、免疫荧光化学检测。或于打开胸腔后,剪开左心耳,经右心室插入套管至肺动脉,注入10ml生理盐水洗净肺内残血,收集肺组织,置于无Rnase的Eppendorf管中,液氮速冻,-80℃冰箱保存,用于RT-PCR及Western-blot检测。　　 三、AECⅡ细胞的分离、培养及鉴定　　 新生Wistar大鼠经5%水合氯醛(0.6ml/100g)腹腔麻醉后处死,无菌条件下迅速取肺,分别采用胰酶和胶原酶消化、离心分离纯化新生鼠AECⅡ细胞,并进行原代培养,经SP-C蛋白免疫荧光染色及透射电镜方法鉴定后用于实验。　　 四、体外肺上皮屏障建立　　 将存活率大于90%AECⅡ以106/cm2密度接种于可通透的纤维连接蛋白包被的多聚碳滤膜上(孔径0.4μm2,TRANSWELL,ComingInc),上室和下室液均为含10%胎牛血清的DMEM培养液,连续培养5天后形成紧密连接的单层细胞片,经形态、表型和功能鉴定后用于实验。　　 五、实验方法和观察指标　　 (一)肺形态学观察:切片进行常规HE染色,光镜下动态观察肺组织的病理改变及进行肺损伤评分。　　 (二)肺组织湿干比(W/D)和肺血管外肺水含量(ELWC)测定。　　 (三)FD4检测肺上皮通透性。　　 (四)免疫荧光及Western-blot技术观察和检测肺组织、原代培养AECⅡ细胞及肺上皮屏障ZO-1蛋白的表达状态及水平。　　 (五)RT-PCR检测肺组织、原代培养AECⅡ细胞及肺上皮屏障ZO-1mRNA表达水平。　　 (六)透射电镜观察肺组织上皮细胞间及体外肺上皮屏障紧密连接结构。　　 (七)跨膜电阻测量记录模式和单细胞层示踪剂流量测定肺上皮屏障功能。　　 六、统计学分析　　 应用SPSS18.0统计软件分析,实验数据以均数±标准差(x±s)表示,计量资料采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni,显著性检验水平为0.05。　　 结果：　　 一、肺形态学观察　　 (一)肺组织病理改变　　 对照组3d时终末气腔大小欠规则,数量较多,肺泡间隔稍厚;实验组3d时可见小血管扩张、充血,肺泡问隔内有少量出血、水肿,渗出以中性粒细胞为主,间质内细胞增多。对照组5d时肺泡形念较规则,大小均匀;实验组5d时肺泡间隔进一步增厚,水肿继续加重,肺泡腔内可见红细胞和炎细胞浸润。对照组7d时肺泡化,肺泡分隔逐步增加,小肺泡数量增多等;而实验组出现肺泡内出血、水肿、炎症细胞浸润、间质细胞增多,同时可见透明膜形成、小肺泡数量减少及肺泡分隔减少等。　　 (二)肺损伤评分　　 高氧1d较对照组无统计学差异(P＞0.05),实验组3d,5d和7d肺损伤评分明显高于对照组(P＜0.01)。　　 二、肺组织湿干比(W/D)和肺血管外肺血(EVLW)　　 W/D于实验后1d,两组比较无统计学差异(P＞0.05),3d起W/D实验组升高(P＜0.05),5d、7d更明显(P＜0.01);ELWC于实验后1d,两组比较无统计学差异(P＞0.05),3d、5d和7d实验组明显升高(P＜0.01)。　　 三、肺上皮通透性　　 两组1d无统计学差异,3d高于对照组(P＜0.05),5d和7d明显高于对照组(P＜0.01)。　　 四、肺组织、原代培养AECⅡ细胞及肺上皮屏障ZO-1及occludin蛋白的表达状态及水平　　 (一)肺组织ZO-1及occludin蛋白表达　　 实验组和对照组比较,生后1d,两组ZO-1蛋白表达无差异(P＞0.05),生后3d、5d和7d实验组较对照组明显减少(P＜0.01);免疫荧光示对照组ZO-1红色荧光成连续性分布于肺上皮细胞膜,实验组红色荧光成断续分布且荧光强度减弱,高氧5d和7d改变最明显。　　 实验组和对照组比较,生后1d和3d,两组occludin蛋白表达无差异(P＞0.05),生后5d蛋白表达开始减少(P＜0.05),7d实验组较对照组明显减少(P＜0.01);免疫荧光示对照组occludin绿色荧光成连续性分布于肺上皮细胞膜,实验组绿色荧光成断续分布且荧光强度减弱,高氧7d改变最明显。　　 (二)原代培养AECⅡ细胞ZO-1及occludin蛋白表达　　 实验组和对照组比较,培养24h,两组ZO-1蛋白表达无差异(P＞0.05),培养48h和72h实验组较对照组明显减少(P＜0.01);免疫荧光示对照组ZO-1红色荧光成网格状连续分布于AECⅡ细胞膜,实验组红色荧光成断续分布且荧光强度减弱,高氧72h改变最明显。　　 实验组和对照组比较,培养24h、48h和72h实验组较对照组均有减少,但两组occludin蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05):免疫荧光示对照组与实验组occludin绿色荧光均成连续性分布于AECⅡ细胞膜。　　 (三)肺上皮屏障ZO-1及occludin蛋白表达　　 实验组24h、48h和72hZO-1蛋白表达较对照组明显减少(P＜0.01);免疫荧光示对照组ZO-1红色荧光成网格状连续分布于肺上皮,实验组红色荧光成断续分布且荧光强度减弱,高氧72h改变最明显。　　 实验组24h、48h和72hoccludin蛋白表达实验组较对照组均有减少,但差异无统计学意义(P＞0.05);免疫荧光示对照组与实验组occludin绿色荧光均成连续性分布于AECⅡ细胞膜。　　 五、肺组织、原代培养AECⅡ细胞及肺上皮屏障ZO-1及occludinmRNA表达水平　　 (一)肺组织ZO-1及occludinmRNA表达水平　　 生后1d、3d、5d和7d实验组ZO-1mRNA表达水平较对照组明显减少(P＜0.01)。实验组和对照组比较,生后1d和3d实验组occludinmRNA表达水平较对照组差异无统计学意义(P＞0.05),生后5d实验组occludinmRNA表达水平较对照组减少(P＜0.05),生后7天减少最明显(P＜0.01)。　　 (二)原代培养AECⅡ细胞ZO-1及occludinmRNA表达水平　　 实验组和对照组比较,培养24h,两组ZO-1mRNA表达水平无差异(P＞0.05),培养48h,实验组较对照组开始减少(P＜0.05),培养72h实验组较对照组明显减少(P＜0.01)。实验组和对照组比较,培养24h、48h和72h实验组较对照组occludinmRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 (三)肺上皮屏障ZO-1及occludinmRNA表达水平　　 实验组24hZO-1mRNA表达水平较对照组增高(P＜0.05),实验组48hZO-1mRNA表达水平较对照组减少(P＜0.05),实验组72hZO-1mRNA表达水平较对照组明显减少(P＜0.01)。实验组24hoccludinmRNA表达水平较对照组增高,但差异无统计学意义(P＞0.05),实验组48h和72hoccludinmRNA表达水平实验组较对照组均有减少,但差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 六、肺组织上皮细胞间及体外肺上皮屏障紧密连接形态　　 (一)肺组织上皮细胞间紧密连接　　 对照组肺上皮细胞间紧密连接位于上皮顶端,成致密线性结构;实验组5d可见紧密连接成线性开放状态,7d开放缝隙最明显,1d和3d未见开放。　　 (二)体外肺上皮屏障紧密连接　　 对照组肺上皮细胞间紧密连接位于上皮顶端,成致密线性结构;实验组48h可见紧密连接成线性开放状态,72h开放缝隙最明显,24h未见开放。　　 七、体外肺上皮屏障功能　　 (一)跨上皮电阻　　 实验组24h较对照组减少有统计学意义(P＜0.05),48h和72h减少更加明显(P＜0.01)。　　 (二)单细胞层示踪剂流量　　 实验组24h较对照组增加无统计学意义(P＞0.05),实验组48h较对照组增加有统计学意义(P＜0.05),72h增加更加明显(P＜0.01)。　　 结论：　　 (一)本研究在进一步证实高氧致BPD早期存在肺水肿基础上,发现了此阶段肺上皮屏障紧密连接开放,此变化与紧密连接关键蛋白ZO-1和occludin相关。　　 (二)高氧下调ZO-1表达导致肺上皮屏障TJ结构和功能破坏可能是新生鼠高氧肺损伤早期肺水肿形成重要机制。　　 (三)MMP-9可破坏紧密连接结构和功能,其作用可能通过降解ZO-1而实现。