豆蔻酸在DNA病毒诱导的固有免疫反应中的作用与分子机制研究

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研究背景病毒感染导致的慢性炎症和突发性疾病严重危害着人类的健康。在与病毒长期相互对抗和共同进化过程中,宿主形成了高效且精细的抗病毒固有免疫系统。固有免疫是机体抵抗病毒入侵的第一道防线,在病毒感染早期,迅速激活抗病毒信号通路来抵御和清除入侵病毒。然而,病毒也进化出一系列免疫逃逸机制来拮抗宿主抗病毒固有免疫反应。因此,揭示宿主抗病毒免疫系统与病毒相互作用的精准调控机制对防治病毒感染性疾病尤为重要。模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRs)可识别病毒结构中相对保守的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)。cGAS-STING抗病毒固有免疫信号通路可以介导对病毒DNA的识别,并通过诱导Ⅰ型IFNs(IFNα/β)和多种干扰素刺激基因(IFN-stimulatedgenes,ISGs)表达来进一步完善宿主抗病毒防御体系。因此,cGAS-STING介导的DNA识别信号通路是启动宿主抗病毒固有免疫应答的关键步骤。STING结合cGAMP(cyclicGMP-AMP)后发生构象变化和亚细胞定位的改变,同时招募TANK结合激酶1(TANK-bindingkinase1,TBK1)和干扰素调控因子3(interferonregulatoryfactor3,IRF3)的聚集。多种蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodification,PTMs)已经被报道对天然免疫系统的活化有重要的作用,其中磷酸化和泛素化等翻译后修饰对STING的影响已被广泛阐明,而作为内源性代谢产物的小分子脂质介导的棕榈酰化、羰基化和烷基化等翻译后修饰也被揭示可调控STING的功能。STING不仅可以通过介导TBK1和IRF3依赖途径激活下游抗病毒基因表达发挥抗病毒作用,还可以通过独立于TBK1和IRF3以及下游IFN-β表达的方式诱导非经典的自噬途径的发生,清除胞质内的病原体。综上所述,STING的功能对抗病毒天然免疫反应的激活和自噬途径清除病毒都具有重要的作用。因此,STING的适度活化对清除入侵机体的病毒和维持机体的免疫稳态至关重要。病毒感染可诱导免疫细胞的代谢重编程,从而促进病毒复制和免疫逃逸。病毒感染可直接诱导宿主脂肪酸代谢紊乱。多种病毒操控宿主脂肪酸代谢以满足自身复制需求。胆固醇代谢紊乱、脂质过氧化失平衡以及脂肪酸参与蛋白质翻译后修饰等过程均可以被病毒利用来抑制宿主固有免疫反应。因此,脂肪酸代谢对免疫系统活化至关重要,然而脂肪酸代谢在cGAS-STING介导的抗病毒通路中的作用仍未阐述清楚。豆蔻酸(myristicacid,MA,C14:0)参与多种细胞内生理活动,食物摄取、脂肪酸的从头合成和脂肪动员可以为机体提供游离的豆蔻酸,并为N-豆蔻酰化修饰提供原料。N-豆蔻酰化修饰的蛋白质在细胞内主要通过介导蛋白质的膜定位,从而影响N-豆蔻酰化修饰蛋白质的亚细胞定位和蛋白质-蛋白质相互作用。豆蔻酸在病毒感染过程中是否会影响cGAS介导的DNA识别信号通路尚不清楚。目前,病毒通过诱导脂肪酸代谢紊乱来影响cGAS-STING信号介导的固有免疫反应的机制研究尚不完善,豆蔻酸在其中发挥的功能亦不明晰。因此,我们以Ⅰ型单纯疱疹病毒(typeⅠherpessimplexvirus,HSV-1)感染作为研究模型,探讨DNA病毒感染诱导的脂肪酸代谢异常是否影响cGAS-STING信号通路介导的固有免疫应答。该研究旨在发现介导cGAS-STING信号通路活化的新机制,为全面了解STING的功能提供新见解,为治疗病毒感染性疾病提供新策略。研究目的本研究旨在揭示病毒感染、脂肪酸代谢和cGAS-STING信号通路介导的固有免疫反应之间的调控网络,发现新的调控机制,为抗病毒治疗的新靶标提供理论依据。方法和结果1.豆蔻酸选择性抑制DNA病毒感染诱导的cGAS-STING信号通路活化1.1Real-timePCR和ELISA检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用豆蔻酸(200μM)预处理显著抑制DNA病毒HSV-1和干扰素刺激DNA(Interferon-stimulatingDNA,ISD)诱导的干扰素β(interferon-β,Ifnb)mRNA的表达和IFN-β的蛋白质分泌。然而,由维甲酸诱导基因Ⅰ受体(RIGlikereceptor,RLR;)的配体RNA病毒诱导的IfnbmRNA表达和IFN-β蛋白质分泌不受豆蔻酸的影响。豆蔻酸处理显著促进HSV-1病毒蛋白质基因UL30mRNA的表达。以上数据表明,豆蔻酸选择性的抑制DNA病毒感染诱导IFN-β的表达,并促进HSV-1病毒复制,而对RNA病毒识别信号通路的活化没有影响。1.2免疫印迹和Real-timePCR检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用豆蔻酸(200μM)预处理显著抑制DNA病毒HSV-1和干扰素刺激DNA(ISD)诱导的STING下游分子TBK1、IRF3和STAT1的磷酸化水平和ISGs的mRNA的表达,但对RNA病毒SeV导致的蛋白质磷酸化水平没有影响。以上结果说明,豆蔻酸刺激能显著抑制由DNA病毒诱导的STING下游分子活化。2.STING是豆蔻酸调控DNA识别信号通路的靶点荧光素酶报告基因检测结果显示,只用豆蔻酸(200μM)处理转染过指定接头分子的HEK293T细胞,豆蔻酸显著抑制cGAS-STING诱导的IFN-β荧光素酶报告基因表达,而TBK1和IRF3-5D介导的IFN-β荧光素酶报告基因表达不受豆蔻酸的影响。Real-timePCR和免疫印迹检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用不同剂量的豆蔻酸(0-300μM)预处理显著抑制STING激动剂cGAMP和DMXAA诱导的IfnbmRNA表达和IFN-β蛋白质分泌以及STING下游分子TBK1、IRF3和STAT1的蛋白质磷酸化水平。以上数据表明,豆蔻酸通过靶向STING来抑制IFN-β表达和STING下游分子活化。3.豆蔻酸通过N-豆蔻酰化抑制cGAS-STING信号通路活化3.1Real-timePCR、ELISA和荧光素酶报告基因检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用N-豆蔻酰化抑制剂2-HOM(100μM)、DDD85646(5μM)或IMP-1088(1μM)预处理显著促进HSV-1、ISD以及cGAMP和DMXAA诱导的IfnbmRNA表达、IFN-β蛋白质分泌和荧光素酶报告基因表达。以上结果表明,N-豆蔻酰化介导cGAS-STING信号通路诱导的IFN-β表达。3.2免疫印迹检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用不同剂量DDD85646(0-10μM)预处理显著促进HSV-1和DMXAA诱导的STING下游分子TBK1、IRF3和STAT1的磷酸化。以上结果说明,N-豆蔻酰化抑制剂能促STING下游分子活化。3.3Real-timePCR、ELISA检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用N-豆蔻酰化抑制剂DDD85646(5μM)或IMP-1088(1μM)处理能回复由豆蔻酸(200μM)处理造成的ISD以及STING激动剂诱导的IfnbmRNA表达、IFN-β蛋白质分泌的抑制作用。以上结果说明,豆蔻酸抑制cGAS-STING信号通路活化的作用依赖于N-豆蔻酰化的发生。4.豆蔻酸通过促进STING复合体的降解来抑制cGAS-STING信号通路的活化免疫印迹检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用不同剂量豆蔻酸(0-300μM)预处理显著促进HSV-1诱导的STING复合体STING、TBK1、IRF3的蛋白质降解但是STAT1的蛋白质水平不受影响。以上结果说明,N-豆蔻酰化抑制剂能促进STING下游分子活化。免疫印迹检测结果显示,在HEK293T细胞中高表达STING后,豆蔻酸(200μM)预处理促进cGAMP刺激诱导的STING的降解,但是在N-豆蔻酰化抑制剂DDD85646(0-10μM)处理后,以剂量依赖性的方式抑制了STING的降解。以上结果说明,豆蔻酸通过N-豆蔻酰化来促进STING复合体的蛋白质降解来抑制cGAS-STING信号通路的活化。5.豆蔻酸通过促进STING依赖的自噬途径来抑制cGAS-STING信号通路的活化免疫印迹检测结果显示,在HEK293T细胞中高表达STING后,豆蔻酸(200μM)预处理促进cGAMP刺激诱导的STING的降解,但是在引入自噬溶酶体抑制剂Chloroquine(100μM),3-MA(250μM)以后挽救了STING的降解,而蛋白质酶体抑制剂MG132(10μM)不能逆转这一现象。免疫印迹检测结果显示,在小鼠腹腔原代巨噬细胞中使用豆蔻酸(200μM)预处理显著促进DNA病毒诱导的STING复合体STING、TBK1、IRF3的蛋白质降解但是在引入自噬溶酶体抑制剂Chloroquine(100μM)以后挽救了STING的降解,STAT1的蛋白质水平不受豆蔻酸(200μM)和Chloroquine(100μM)影响。以上结果说明,豆蔻酸依赖N-豆蔻酰化促进STING依赖的自噬途径,并以此来抑制cGAS-STING信号通路的活化。结论及意义本研究发现,豆蔻酸特异性抑制cGAS-STING通路介导的抗病毒固有免疫活化,而对MDA5以及及RIG-Ⅰ介导的Ⅰ型IFNs表达的没有影响。同时,我们发现,豆蔻酸通过N-豆蔻酰化抑制cGAS-STING信号通路活化,药理学抑制N-豆蔻酰化可以回复由豆蔻酸预处理造成的免疫抑制作用。进一步的机制探讨发现,豆蔻酸能促进STING复合物的自噬降解,导致cGAS-STING信号通路的抑制。本研究阐明了脂肪酸代谢产物豆蔻酸在cGAS-STING信号通路激活中的新作用机制,有助于进一步揭示脂肪酸代谢、固有免疫反应与病毒感染之间的调控网络。创新性1.发现了豆蔻酸作为一种小分子天然代谢产物抑制cGAS-STING介导的天然免疫反应,并促进HSV-1在细胞内复制;2.阐明了豆蔻酸通过N-豆蔻酰化促进STING复合体蛋白质自噬降解,进而影响下游分子活化的新机制。
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