维吾尔药大苞荆芥对哮喘小鼠TGF-β/Smads通路的影响及Th17/Treg调节机制研究

来源 :新疆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:knighthaha
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目的:研究哮喘患者Th1、Th2、Th17及Treg细胞相关炎性因子的变化规律,探索哮喘肺内炎症发生发展的分子机制。通过大苞荆芥对支气管哮喘小鼠的干预实验,探讨维药大苞荆芥对支气管哮喘小鼠模型TGF-β/Smads信号通路介导Th17/Treg平衡的调节作用机制并评价并分析大苞荆芥对两者的调节作用。  方法:⑴采用多重蛋白定量技术(CBA法)检测支气管哮喘患者及正常人群血清中 Th1、Th2、Th17及Treg细胞相关细胞因子的蛋白表达变化;⑵将支气管哮喘模型小鼠分为6组,分别为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组、大苞荆芥高剂量治疗组、大苞荆芥中剂量治疗组及大苞荆芥低剂量治疗组。釆用卵清蛋白(OVA)联合 Al(OH)3致敏法制备小鼠支气管哮喘模型;观察小鼠的行为学变化,采用肺组织切片HE染色观察、气道阻力测定、气道肺泡灌洗液中炎性细胞分类计数结果,测定气道高反应性;⑶流式细胞术检测支气管哮喘模型小鼠 Th17/Treg细胞特异性标志物IL-17a+Th17、Foxp3+Treg及Th17/Treg比值的变化情况;⑷采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测支气管哮喘小鼠Th17/Treg细胞相关细胞因子IL-10、IL-17a、IL-23、RORγt转录水平变化情况,以及TGF-β/Smads信号通路中细胞相关细胞因子IL-6、Smad2/3、Smad7、TGF-β转录水平变化情况;⑸酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血清中Th17/Treg细胞相关细胞因子IL-10、IL-17a、IL-6、TGF-β水平的变化情况,以及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF)中IL-4水平的变化情况。Western-Blot法测定 pSmad2/3、pSmad7蛋白的表达情况。  结果:①在支气管哮喘患者血清中TGF-β(Treg)、IL-4(Th2)、IL-6、IL-17a(Th17)的细胞因子表达水平明显高于正常人群,且差异有统计学意义(P<0.05)。在支气管哮喘患者与正常人群血清中 IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表达水平未见明显差异(P>0.05);②通过对小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞进行分类计数发现:支气管哮喘小鼠模型中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数明显增高,巨噬细胞计数明显降低;支气管哮喘模型小鼠的细胞分类以嗜酸性粒细胞为主;通过测定各组间小鼠气道阻力的影响,发现与正常对照组相比各组间气道阻力具明显增加。哮喘模型组乙酰胆碱激发后可见,小鼠气道阻力明显增加,与其他各组相比差异明显且有统计学意义(P<0.05)。四个治疗组(地塞米松及大苞荆芥)经乙酰胆碱激发后气道阻力较正常组均增加,且差异有统计学意义(P<0.05);但哮喘小鼠模型组相比较后我们可以发现,四个治疗组(地塞米松及大苞荆芥)气道阻力均明显减小差异有统计学意义。治疗组各组间地塞米松组与大苞荆芥各组相比气道阻力增加不明显,大苞荆芥各治疗组气道阻力依大苞荆芥剂量递减而逐渐增强。高剂量组气道阻力较低,低剂量组气道阻力较高。HE染色结果显示,哮喘模型组小鼠支气管及肺泡组织结构发生改变,部分结构消失。支气管粘膜可见大量炎症细胞浸润,支气管出现收缩的现象,管腔变窄,气道上皮排列不整齐,甚至出现断裂的情况。治疗组较模型组的炎症细胞浸润情况明显减轻;支气管收缩较模型组好转;管腔变窄情况模型组明显改善,管腔直径较模型组明显变宽;③流式细胞术检测结果显示:地塞米松组及不同剂量干预组Th17细胞百分比均明显高于空白对照组(P<0.01),同时均低于支气管哮喘小鼠模型组(P<0.01)。地塞米松组及不同剂量干预组Treg细胞百分比均明显低于空白对照组(P<0.01),同时均高于支气管哮喘小鼠模型组(P<0.01)。地塞米松组及不同剂量干预组Th17/Treg细胞比值均明显高于空白对照组(P<0.01),同时均低于支气管哮喘小鼠模型组(P<0.01);④qRT-PCR结果显示:TGF-β/Smad信号通路相关细胞因子IL-6、IL-10、IL-17a、Smad2/3、Smad7、TGF-β的mRNA水平在支气管哮喘模型小鼠中均有明显改变。在各支气管哮喘模型小鼠组中IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-βmRNA的表达均显著高于对照组;地塞米松可以显著降低模型组中 IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-β的mRNA表达情况,大苞荆芥也可以降低模型组中IL-6、IL-17a、Smad2/3、TGF-β的mRNA表达。在各支气管哮喘模型小鼠组中Smad7的mRNA的表达均显著低于对照组;地塞米松与大苞荆芥都可以显著增加模型组中Smad7的mRNA表达;⑤ELISA结果显示:炎性细胞相关因子IL-4、IL-10、IL-17a、IL-6、TGF-β在支气管哮喘模型小鼠中均有明显改变。大苞荆芥能够降低支气管哮喘小鼠模型 BALF中 IL-4的表达水平及外周血IL-17a、IL-6、pSmad2/3、TGF-β的表达水平,与此同时增加了外周血IL-10的表达水平。Western-blot结果显示:在支气管哮喘模型小鼠组中pSmad2/3的表达均显著高于对照组(P<0.01),而pSmad7的表达明显低于对照组;地塞米松可以显著降低模型组中pSmad2/3的表达,也可以显著增加模型组中pSmad7的表达,大苞荆芥也起到相似的作用。  结论:⑴支气管哮喘患者外周血中存在CD4+T淋巴细胞免疫失衡,哮喘组患者血清中TGF-β、IL-4、IL-6、IL-17a的表达水平明显高于正常人群,提示哮喘组Th17细胞表达较正常组显著增加,通过调节Th17/Treg细胞比例,可能对干预支气管哮喘进程具有一定的作用;⑵通过OVA气道致敏法,可成功建立支气管哮喘小鼠模型;建立的支气管哮喘模型小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎细胞分类以嗜酸性粒细胞为主;支气管哮喘模型小鼠气道阻力明显增高;初步确认大苞荆芥可以显著改善支气管哮喘模型小鼠的症状,改善支气管肺泡的病理学变化;降低支气管哮喘模型小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞数量;降低支气管哮喘模型小鼠的气道高反应性;⑶地塞米松和大苞荆芥能够使 Th17细胞数量减少同时使得 Treg细胞增加。大苞荆芥和地塞米松均可以显著的恢复Th17/Treg细胞分化的平衡的能力。提示大苞荆芥可能通过某种方式参与Th17/Treg细胞分化及相关细胞因子的调节;⑷研究发现TGF-β信号是初始T细胞分化成Th17与Treg细胞时必不可少的信号分子之一,TGF-β与IL-6的协同作用在Th17细胞分化中起到十分重要的作用,Smad2/3与Smad7的磷酸化也是影响 Th17细胞分化的重要调控因素之一;⑸本研究通过建立并观察小鼠支气管哮喘模型,发现在支气管哮喘发生时,炎症反应随之发生,TGF-β/Smad通路上的关键细胞因子TFG-β与Smad2/3、IL-6的表达皆有升高,TGF-β/Smad通路被激活,与此同时Th17/Treg细胞比值表现出明显上升;⑹而在地塞米松及大苞荆芥的作用下,该通路中TGF-β,IL-6与磷酸化的Smad2/3皆随之下降,而磷酸化的Smad7则开始上调,而此时也伴随着Th17/Treg细胞比值明显下降。由此我们推测TGF-β/Smad在支气管哮喘的发生过程中起到促炎的作用;⑺而大苞荆芥可能通过调节小鼠体内TGF-β/Smad通路下游关键信号分子Smad2/3及Smad7的磷酸化进而影响TGF-β与IL-6的表达,进一步影响调节Th17与Treg的分化,从而对小鼠支气管哮喘的炎症产生抑制作用,而对于探明大苞荆芥的有效作用靶点和更深一步的影响作用机制而言还需要在以后的研究工作中进行更加深入的探讨。
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