繁殖障碍性疾病对奶牛生产造成巨大损失,尽早诊断妊娠状况能够有效避免奶牛生产过程中的无效饲养、繁殖周期延长等问题。因此,探索奶牛正常妊娠相关的分子标记物对进一步理解母胎免疫耐受机制,指导奶牛实际生产具有非常重要的意义。由于绝大多数细胞均能够分泌外泌体,并且其分泌量和内容物(核酸、蛋白质和脂质等)在正常及病理状态下会存在显著差异,因此外泌体备受科研工作者关注。基于外泌体的分子诊断技术被认为是一项非常有前景的新型疾病诊疗手段。哺乳动物(包括人)妊娠期间大量胎盘源外泌体差异性携带miRNA进入母体血液循环,构成母体血液循环中外泌体主要成分,研究这些差异分拣的miRNA或可反映妊娠进展和胎儿的生长发育情况。此外,外泌体miRNA也可能参与调节哺乳动物妊娠期间胎儿免疫耐受的机制,但是其在奶牛妊娠过程中的功能研究鲜有报道。本文以不同妊娠时期荷斯坦奶牛为研究对象,运用高通量测序技术比较未孕(gestational day,G_D 0)以及正常妊娠早期(G_D 60)、中期(G_D150)和晚期(G_D 240)奶牛外周血浆中外泌体的miRNAs富集差异,揭示了妊娠各个时期特异性miRNAs;重点探讨了妊娠早期外泌体中差异富集最显著的bta-miR-499对母体子宫免疫微环境的分子调控机制,为进一步探索妊娠外泌体miRNAs的生物作用和可能的临床应用价值奠定科学基础,相关研究结果与结论如下:1.本文采用超高速离心法从奶牛的外周血浆中分离外泌体,利用透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体形态及粒子直径分布进行分析。结果显示电镜下分离物呈现典型的杯盘状双层膜立体结构,粒子直径大小主要分布在30-140nm之间,符合典型的外泌体特征。免疫印迹分析外泌体标记蛋白CD63和CD9以及胎盘特异外泌体标记蛋白胎盘碱性磷酸酶(Plancental Alkaline Phosphatase,PLAP),结果显示各组外泌体均表达CD63和CD9,且除未孕奶牛外,妊娠各组外泌体均表达PLAP蛋白,表明妊娠期间大量胎盘源外泌体存在。随后采用ELISA法检测妊娠各时期外泌体中PLAP含量,结果发现随着妊娠进展,外泌体PLAP表达量呈上升趋势,这与外周血中外泌体浓度趋势一致。因此推测在奶牛妊娠期间,胎盘来源的外泌体大量释放到母体血液循环中导致外周血中外泌体含量显著上升。2.外泌体在不同生理条件下所富集的miRNA存在显著差异。本文通过高通量测序技术筛选出了妊娠各个阶段血浆妊娠外泌体差异性miRNAs,如妊娠早期的bta-miR-499、bta-miR-16a、bta-miR-20a、bta-miR-223和bta-miR-128等,妊娠中期的bta-miR-493、bta-miR-127和bta-miR-143等以及妊娠晚期的bta-miR-122、bta-miR-182、bta-miR-183、bta-miR-200b和bta-miR-200c等,推测各妊娠阶段妊娠外泌体差异性miRNAs可能参与母体与胎儿交流。3.妊娠早期子宫免疫微环境的变化对妊娠建立至关重要。通过比较未孕和妊娠早期奶牛外周血浆外泌体中miRNA富集差异,并对其差异miRNAs的候选靶基因进行信号通路注释。结果显示,以bta-miR-499高表达为代表的miRNAs在妊娠早期外泌体中显著富集,这些靶基因主要注释在免疫炎症反应相关的信号通路上,如肿瘤坏死因子信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路、NF-κB信号通路和Ras信号通路等。以上结果表明,妊娠早期外泌体可能通过其富集的miRNAs(如bta-miR-499)发挥免疫炎症调节作用。4.基于以上miRNAs可能参与一系列炎症应答过程,本文进一步分析了妊娠早期奶牛子宫角远端组织促炎因子TNF-α和IL-6的表达水平。qPCR结果显示,与未孕组相比,妊娠早期TNF-α和IL-6呈现显著高表达(p<0.05),同时免疫组织化学结果也证实妊娠早期TNF-α和IL-6阳性表达。以上结果表明,奶牛妊娠早期子宫局部表现为偏向Th1促炎免疫微环境。5.NF-κB是炎症免疫应答主要调节因子之一,可调节下游促炎因子TNF-α和IL-6表达。KEGG分析显示NF-κB信号可能是早期妊娠子宫免疫微环境调节的“开关”。免疫荧光结果显示NF-κB在妊娠早期子宫呈现高表达,提示NF-κB在早期妊娠子宫处于激活状态,可能作为子宫局部促炎/抗炎(Th1/Th2)微环境的转换“开关”。6.体外LPS(1μg/m L)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells,BEND)构建NF-κB激活状态下的促炎子宫微环境模型,探讨妊娠早期外泌体(p-EXO)bta-miR-499对促炎子宫内膜细胞的调节潜能。结果显示,TNF-α和IL-6在LPS刺激BEND细胞后表达显著上调(p<0.05),然而共孵育p-EXO(10μg/m L)后该趋势出现逆转,但是共孵育同浓度的未孕组外泌体(n-EXO)未出现逆转现象。qPCR结果显示共培养p-EXO的BEND细胞bta-miR-499的表达水平显著升高(p<0.05),并且转染bta-miR-499模拟物后显著减弱了LPS诱导的TNF-α和IL-6表达。以上结果表明,早期妊娠外泌体bta-miR-499(p-EXObta-miR-499)具有抑制炎症免疫反应的潜能。7.本文进一步探讨了p-EXO-bta-miR-499是否通过抑制NF-κB通路的激活来调节促炎细胞因子的表达。免疫荧光结果显示,p-EXO减弱了LPS诱导BEND细胞NF-κB入核现象,但n-EXO组无明显变化,同时过表达bta-miR-499得到相似的结果。以上结果表明,p-EXO-bta-miR-499可能通过抑制NF-κB信号激活调节促炎因子表达。8.miRNA可通过抑制靶基因表达来参与下游生物学活动。双荧光素酶报告实验证实bta-miR-499直接靶向Lin28B mRNA的3’UTR从而抑制胞内Lin28B的表达水平。Let-7家族在炎症应答中能够调控NF-κB信号激活,而Lin28B被认为是let-7家族表达的抑制因子。为了探讨bta-miR-499是否通过靶向Lin28B上调let-7家族表达来抑制NF-κB的激活,将agomiR-499转染BEND细胞后发现let-7家族的表达显著增加,这与si RNA干扰Lin28B表达后的结果相似,而过表达Lin28B显著抑制了let-7家族成员的表达,以上结果表明miR-499抑制Lin28B表达,提高胞内let-7水平。随后p-NF-κB报告载体和免疫印迹实验直接证实let-7抑制NF-κB信号激活。此外,qPCR结果发现p-EXO中也存在大量let-7富集,但富集的种类与p-EXO处理BEND细胞后上调的let-7家族成员有差异,表明pEXO可以直接递送let-7到靶细胞,也可以通过bta-miR-499/Lin28B上调胞内let-7家族表达水平,从而抑制NF-κB激活进而减弱Th1促炎细胞因子表达,调节局部炎症微环境。9.采用体外小鼠妊娠模型进一步论证研究结果。在ICR小鼠妊娠的第5.5天(E5.5,以发现小鼠阴道栓为基准,记为妊娠第0.5天,即E0.5)和E7.5注射miR-499抑制剂(0.5μmol/kg,i.p.),对照组妊娠小鼠注射等量的miR-NC,于E8.5和E14.5收集样品。结果显示miR-499抑制剂干预下小鼠胚胎数量显著减少(p<0.05),小鼠妊娠中期(E14.5)胎儿平均体重较miR-NC组显著降低(p<0.05),表明miR-499抑制剂干预可能改变了子宫局部微环境导致胎鼠生长抑制。随后为进一步探究以上结果是否由于子宫局部炎症微环境的变化引起,分别采用免疫荧光技术和qPCR分析各组NF-κB p65,IL-6和TNF-α的表达,结果显示抑制miR-499导致NF-κB异常激活以及促炎因子显著上调表达(p<0.05)。由此推测,小鼠早期妊娠的建立与维持依赖于适度的子宫促炎微环境,随着miR-499抑制剂的干预,破坏了局部促炎/抗炎细胞因子平衡,导致胚胎流失和胎儿生长抑制等妊娠异常风险增加。结论:(1)奶牛妊娠各时期以胎盘外泌体为主的妊娠相关外泌体差异富集miRNAs,并被大量释放到母体血液循环中,这些miRNAs的发现为探索正常妊娠相关分子标记物提供了参考,也为研究妊娠期间母胎交流机制打开了新的思路;(2)妊娠早期外泌体通过递送let-7和miR-499等直接或间接靶向NF-κB信号通路,调节子宫局部免疫微环境促炎/抗炎平衡,为奶牛母胎免疫耐受机制提供了新的科学依据。