论文部分内容阅读
目的:探索核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体在血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)诱导的高血压肾病中的作用,观察迷迭香酸(Rosmarinic Acid,RA)是否可以减轻Ang II诱导的高血压肾病,并初步探索其作用的可能机制。方法:6~8周龄C57BL/6小鼠通过皮下微量泵注Ang II的方式建立高血压肾病模型,实验分组:Control组、Ang II组(1.46 mg·kg-1·d-1)、Ang II+RA组(Ang II 1.46 mg·kg-1·d-1+RA 50 mg·kg-1·d-1)。每组10只,干预4周。每周通过尾套法定期监测血压;造模结束后,将小鼠装入24 h代谢笼收集小鼠24 h尿并处死小鼠收集血液;南京建成相关检测试剂盒检测尿微量白蛋白、血肌酐及血尿素氮含量;免疫荧光检测肾组织巨噬细胞浸润情况;Masson染色检测肾组织纤维化程度;NADP+/NADPH检测试剂盒检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)氧化酶的活性;二氢乙啶超氧化物阴离子探针检测肾组织ROS水平;实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)及免疫印迹检测NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox及NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASC)、胱天蛋白酶1(Caspase-1)、IL-1β、IL-18的表达水平。体外培养人肾小管上皮(HK-2)细胞。实验分组:Control组、RA组(50μmol/L)、H2O2组(100μmol/L)、H2O2+RA组(H2O2100μmol/L+RA 50μmol/L)。荧光显微镜检测细胞ROS的变化;免疫印迹检测细胞NLRP3炎症小体的表达;ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18的含量。结果:1.在血管紧张素II诱导的高血压肾病模型中NLRP3炎症小体的表达增加与对照组相比,Ang II组小鼠出现血压升高,血肌酐、血尿素氮水平增加,尿微量白蛋白排泄增加(P<0.05);免疫荧光显示,Ang II组巨噬细胞浸润增加(P<0.05);Masson染色显示Ang II组肾组织纤维化程度加重(P<0.05);实时定量聚合酶链式反应及免疫印迹检测肾组织NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18的RNA合成和蛋白表达增加(P<0.05)。2.迷迭香酸通过抑制NADPH氧化酶/ROS/NLRP3炎症小体通路的激活减轻高血压肾病迷迭香酸显著减轻了Ang II诱导的高血压肾病。与Ang II组相比,给予迷迭香酸处理后,Ang II+RA组血压明显降低,血肌酐、血尿素氮水平下降,尿微量白蛋白排泄减少(P<0.05);免疫荧光显示,Ang II+RA组巨噬细胞浸润明显减少(P<0.05);Masson染色显示,给予迷迭香酸后肾组织纤维化程度显著改善,Col-1、α-SMA的RNA及蛋白表达降低(P<0.05)。进一步的结果显示,与Ang II组相比,Ang II+RA组NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18的RNA及蛋白合成下降(P<0.05);给予迷迭香酸处理后,NADPH氧化酶的合成及活性下降,ROS生成减少(P<0.05)。3.迷迭香酸抑制H2O2刺激HK-2细胞中ROS、NLRP3炎症小体相关分子的表达H2O2刺激HK-2细胞后,细胞ROS水平增加,NLRP3炎症小体及其下游IL-1β、IL-18蛋白表达增加(P<0.05);给予迷迭香酸处理后,细胞ROS水平下降,NLRP3炎症小体及其下游IL-1β、IL-18蛋白表达下降(P<0.05)。进一步在细胞层面上证明了迷迭香酸可通过减轻NLRP3炎症小体的激活改善高血压肾病。结论:1.高血压肾病NLRP3炎症小体表达增加,NLRP3炎症小体在促进高血压肾病肾脏炎症和纤维化及加重肾功能损伤中发挥重要作用。2.迷迭香酸可减轻Ang II诱导的高血压肾病,其主要是通过抑制NLRP3炎症小体的激活发挥作用。进一步研究发现,迷迭香酸对NLRP3炎症小体的抑制主要是通过对其上游NADPH氧化酶的抑制发挥作用,即迷迭香酸通过抑制NADPH氧化酶/ROS/NLRP3炎症小体通路减轻高血压肾病。