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研究背景和目的:缺血性脑卒中是一种具有高致残致死率的、严重危害人民生命安全和身体健康的常见脑血管病。缺血性脑卒中是一种急性发作的疾病,减少因缺血时间累积导致的进行性神经组织失功能是急性期治疗的主要目的。因此研究脑缺血再灌注损伤机制并减轻其不良后果有助于优化现有的临床诊疗方案,减轻缺血性脑卒中造成的沉重的社会和经济负担。目前证实细胞凋亡、氧化应激等参与了脑缺血再灌注,但铁死亡在脑缺血再灌注中的研究甚少。同时,脑缺血再灌注期间存在线粒体自噬失衡,但线粒体自噬强度对脑缺血再灌注损伤的影响尚不清晰。黄芩素是脂氧合酶抑制剂,理论上可抑制铁死亡。因此,本研究拟通过糖氧剥夺—复氧（OGD/R,oxygen-glucose deprivation and reoxygenation）和小鼠短暂大脑中动脉闭塞（tMCAO,transient middle cerebral artery occlusion）建立缺血性脑卒中再灌注的体外和体内模型,探讨铁死亡在脑缺血再灌注损伤中的作用以及黄芩素对脑缺血再灌注损伤的保护机制,揭示脑缺血再灌注损伤的调控机制,加深对脑缺血再灌注损伤机制的理解,为创新优化缺血性脑卒中的临床诊疗提供理论基础和思路。研究内容:1.利用海马神经元细胞建立OGD/R的脑缺血再灌注损伤体外模型。实验分5组:正常糖氧细胞培养对照组、OGD/R模型组、不同剂量黄芩素（0.8μM,4μM,20μM）干预组。通过检测细胞活力、线粒体膜电位、LDH释放水平、氧化应激反应、铁死亡相关蛋白等指标,明确铁死亡在OGD/R细胞损伤中的作用和黄芩素可能的神经保护作用及其可能机制。2.采取线栓法建立tMCAO小鼠动物模型,模拟体内脑缺血再灌注模型。实验分6组:无处理对照组、假手术组、tMCAO组、tMCAO+药物溶剂组、tMCAO+黄芩素组（10mg/kg或80mg/kg）。通过脑梗死体积测定、神经功能损伤行为学评分、超微细胞形态学观察、脂质过氧化活性、内源性抗氧化水平、铁载量和铁死亡相关蛋白表达的检测,明确tMCAO小鼠损伤的可能机制和铁死亡调控黄芩素的神经保护作用机制。3.利用特异性铁死亡诱导剂RSL3诱导HT-22细胞建立铁死亡细胞模型。实验分5组:正常空白对照组、RSL3诱导的铁死亡模型组、RSL3诱导+不同剂量黄芩素（0.8μM,4μM,20μM）干预组。通过检测RSL3诱导细胞活力、线粒体膜电位、氧化应激反应、超微形态学观察、内源性抗氧化水平、脂质过氧化活性、铁载量、铁死亡相关蛋白等指标,明确黄芩素的神经保护作用的可能机制。4.利用RSL3诱导HT-22细胞建立铁死亡细胞模型,引入线粒体自噬的相对特异性抑制剂Mdivi-1进行干预。实验分5组:空白对照组、RSL3铁死亡诱导组、RSL3+mdivi-1联合组、RSL3+黄芩素干预组、RSL3+黄芩素干预+mdivi-1联合组。通过检测细胞活力水平、线粒体自噬流强度、PINK1和Parkin在线粒体和胞浆内表达含量等指标,明确PINK1-Parkin介导的线粒体自噬通路对铁死亡和黄芩素抑制铁死亡作用的影响。研究结果:1.OGD/R脑缺血再灌注损伤体外模型研究（1）与CTRL组相比,OGD/R模型组细胞活力显著降低;与OGD/R模型组相比,黄芩素干预组细胞活力增加,且呈剂量依赖性。（2）与CTRL组相比,OGD/R模型组细胞JC-1平均荧光强度明显下降;与OGD/R组相比,黄芩素干预组细胞JC-1平均荧光强度显著升高,且呈剂量依赖性。（3）与CTRL组相比,OGD/R模型组细胞乳酸脱氢酶释放水平显著升高;与OGD/R组相比,黄芩素干预组细胞乳酸脱氢酶释放水平降低,且呈剂量依赖性。（4）与CTRL组相比,OGD/R模型组细胞DCFH-DA、DHE和Mito SOX Red的荧光强度显著增加;与OGD/R模型组相比,黄芩素干预组后DCFH-DA、DHE和Mito SOX Red的荧光强度降低,且与剂量相关。（5）与CTRL组相比,OGD/R模型组细胞GPX4、FTH1、FTMT、x CT和ACSL3蛋白表达水平显著降低,细胞ACSL4蛋白表达水平升高;与OGD/R组相比,黄芩素干预组细胞GPX4、FTH1、FTMT、x CT和ACSL3的蛋白表达增加,ACSL4蛋白表达水平降低,且与剂量相关。2.tMCAO小鼠体内脑缺血再灌注模型研究（1）与sham组相比,tMCAO组小鼠脑梗死体积显著增加,炎性因子水平升高;与tMCAO组相比,tMCAO+黄芩素组小鼠脑梗死体积显著缩小并且炎性因子水平降低,且与剂量相关。（2）与sham组相比,t MACO组小鼠Bederson score、9 points scale、m NSS和Corner Test的评分/比值显著升高,Garcia scale和Hanging Test评分显著降低;与tMCAO组小鼠相比,tMCAO+黄芩素组小鼠Bederson score、9 points scale、m NSS和Corner Test评分/比值显著降低,Garcia scale和Hanging Test的评分显著升高,且与剂量相关。（3）与sham组相比,t MACO细胞电镜下出现染色质固缩、边缘化及线粒体外膜破裂;tMCAO+黄芩素组神经细胞电镜下变化明显改善,且与剂量相关。（4）与sham组相比,tMCAO组小鼠脑组织内MDA水平显著升高;与tMCAO组相比,tMCAO+黄芩素小鼠脑组织内MDA水平明显下降,且与剂量相关。（5）与sham组相比,tMCAO组小鼠脑组织内NADPH/NADP+比值和总GSH水平显著降低;与tMCAO组小鼠相比,tMCAO+黄芩素组小鼠脑内NADPH/NADP+比值和总GSH水平显著升高,且与剂量相关。（6）与sham组相比,tMCAO组小鼠脑组织内亚铁和总铁水平明显升高;与tMCAO组相比,tMCAO+黄芩素组小鼠脑内亚铁和总铁水平显著降低,且呈现剂量依赖性。（7）与sham组相比,tMCAO组小鼠脑组织内铁死亡抑制蛋白GPX4、FTH1、FTMT、x CT、ACSL3水平明显降低,ACSL4水平显著升高;与tMCAO组相比,tMCAO+黄芩素组小鼠脑组织GPX4、FTH1、FTMT、x CT和ACSL3蛋白表达增加,ACSL4的表达水平显著降低,且呈现剂量依赖性。3.RSL3诱导铁死亡细胞模型研究（1）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞PI荧光强度显著增强,细胞活力下降;与RSL3组相比,黄芩素干预组细胞活力水平显著增加,呈现剂量依赖性。（2）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞JC-1平均荧光强度显著下降;与RSL3模型组相比,黄芩素干预组细胞JC-1平均荧光强度均显著增加,且具有剂量依赖性。（3）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞DCFH-DA、DHE和Mito SOX Red染色的荧光强度明显增加;与RSL3组相比,黄芩素干预组DCFH-DA、DHE和Mito SOX Red的荧光强度降低,且与剂量相关。（4）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞线粒体缩小、线粒体膜增厚;RSL3+黄芩素组细胞电镜下变化明显改善,且呈现剂量依赖性。（5）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞的581/591 C11平均荧光强度和MDA含量明显增加;与RSL3模型组相比,黄芩素干预组细胞的581/591 C11平均荧光强度和MDA水平显著降低,且具有剂量依赖性。（6）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞NADPH/NADP+比值和总GSH水平显著降低;与RSL3组相比,黄芩素干预组细胞NADPH/NADP+比值和总GSH含量增加,且与剂量相关。（7）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞亚铁和总铁含量显著升高;与RSL3组相比,黄芩素干预组细胞的亚铁和总铁水平明显降低,且与剂量相关。（8）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞GPX4、FTH1、FTMT、和ACSL3表达水平显著降低,x CT表达水平变化不明显,ACSL4含量明显升高;与RSL3模型组相比,黄芩素干预组细胞GPX4、FTH1、FTMT、x CT和ACSL3的表达增加,ACSL4表达水平降低,且与剂量相关。4.RSL3诱导铁死亡细胞模型线粒体自噬通路研究（1）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞活力明显降低;与RSL3模型组相比,mdivi-1处理进一步削减细胞的活性,而黄芩素抑制了RSL3导致的细胞活性水平的下降;与RSL3+mdivi-1相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞活力升高;与RSL3+黄芩素相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞活力相对值显著降低。（2）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞TOM20与LC3II共定位比率显著降低;与RSL3模型组相比,mdivi-1进一步削减细胞内TOM20与LC3II共定位水平,而黄芩素能显著增加细胞TOM20与LC3II共定位水平;与RSL3+mdivi-1组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组TOM20与LC3II共定位明显增高;与RSL3+黄芩素组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞中的TOM20与LC3II共定位比例显著降低。与CTRL组相比,RSL3模型组细胞总体LC3II/LC3I比值降低,细胞总体TOM20水平升高不明显,细胞总体TIM23水平升高;与RSL3模型组相比,mdivi-1对细胞总体LC3II/LC3I的比值和TIM23影响不大,但细胞总体TOM20表达水平增加,而黄芩素干预显著增加了细胞总体LC3II/LC3I的比值,并减少了细胞总体TOM20与TIM23的表达;与RSL3+mdivi-1组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞总体LC3II/LC3I的比值升高,TOM20与TIM23含量下降;与RSL3+黄芩素组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞总体LC3II/LC3I的比值降低,细胞总体TOM20与TIM23水平升高。（3）与CTRL组相比,RSL3模型组细胞总体TOM20与Parkin共定位的比值显著降低;与RSL3模型组相比,mdivi-1处理削减细胞总体TOM20与Parkin共定位水平,而黄芩素干预显著增加了细胞总体TOM20与Parkin的共定位;与RSL3+mdivi-1组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞总体TOM20与Parkin共定位水平增高;与RSL3+黄芩素组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞总体的TOM20与Parkin定位比值显著降低。与CTRL组相比,RSL3模型组细胞线粒体及胞浆中PINK1的水平降低,但线粒体及胞浆中Parkin的含量没有明显改变;与RSL3模型组相比,mdivi-1降低了细胞线粒体和胞浆中PINK1、胞浆中Parkin的水平,但对线粒体Parkin含量影响不大,而黄芩素干预显著升高线粒体和胞浆PINK1、Parkin水平;与RSL3+mdivi-1组相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞线粒体和胞浆内PINK1、线粒体Parkin的水平升高,胞浆内Parkin的水平降低;与RSL3+黄芩素相比,RSL3+mdivi-1+黄芩素组细胞线粒体和胞浆PINK1、Parkin水平都明显下降。研究结论:（1）OGD/R细胞模型存在铁死亡,黄芩素能减轻OGD/R诱导的细胞损伤;（2）tMCAO小鼠模型存在铁死亡,黄芩素能减小tMCAO小鼠脑梗死体积,改善其神经功能;（3）黄芩素可能通过降低铁含量、抑制脂质过氧化反应、增加内源性抗氧化活性和调控多种铁死亡相关蛋白表达等多途径抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注损伤;（4）黄芩素抑制铁死亡的作用可能部分与PINK1-Parkin介导的线粒体自噬调节作用相关。