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棉铃虫是一种世界性的重要经济害虫,已对包括拟除虫菊酯类杀虫剂(简称菊酯类杀虫剂)在内的多种杀虫剂产生了严重的抗药性。细胞色素P450(以下简称P450)酶系介导的杀虫剂代谢能力增强是昆虫对菊酯类杀虫剂产生抗药性的重要机制。目前发现P450基因的过量表达、P450基因的氨基酸替换以及二者的联合作用均可能与昆虫的抗药性相关。深入研究抗性棉铃虫细胞色素P450基因,有助于明确棉铃虫对菊酯类杀虫剂的抗性分子机制,为棉铃虫的抗药性治理及菊酯类药剂的合理使用提供理论依据。
本文根据细胞色素P450 CYP687(AF031468)基因的核苷酸序列设计特异性引物,分别以抗氰戊菊酯品系(HDFR)和敏感品系(HDS)棉铃虫六龄中期幼虫中肠组织基因组DNA为模板,克隆了细胞色素P450 CYP687基因。结果表明,抗氰戊菊酯品系和敏感品系目的片段分别为1840bp和1842bp,其中编码区长1515bp,编码504个氨基酸残基,并且分别含有325bp和327bp的内含子。抗性品系的CYP687与敏感品系对比,核苷酸、氨基酸的同源性分别为99.24%和99.40%,编码区存在14个核苷酸突变位点,引起3个氨基酸发生了突变。抗性品系的内含子区有3个核苷酸突变位点,其中有2个为核苷酸缺失。
利用Northern杂交方法检测了CYP687 mRNA在抗氰戊菊酯(HDFR)品系棉铃虫不同发育阶段的表达情况,结果表明,在已检测的棉铃虫不同发育阶段中,CYP687只在棉铃虫幼虫阶段表达,在蛹和成虫阶段均不表达或者表达量极低,且在幼虫阶段随龄期的增大,该基因的表达量有明显的升高。
根据P450氨基酸序列保守性高的位置Ⅰ螺旋区和血红素结合区设计了一对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到了与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的基因片段,但是经测序并与Genebank中序列进行同源性比较后,发现这些片段和Genebank中的P450同源性很高,没筛选到新的P450基因。