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滑膜是包裹着关节囊内面的结缔组织,是滑膜关节的重要组成部分。很多关节疾病的病理进展过程中常伴随滑膜炎症反应,如骨关节炎(osteoarthritis,OA)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)。异常的滑膜炎症反应可以促进软骨的损伤、加速骨赘的形成、降低滑膜关节的疼痛阈值,最终导致患者出现关节疼痛和功能障碍等临床表现。滑膜炎症反应在不同的关节疾病中具有不同的病理特征,其中以巨噬细胞浸润为主的慢性、低度炎症是OA滑膜炎症反应的主要病理表现。研究表明,OA的滑膜炎症反应与OA的发生发展密切相关。因此,调控巨噬细胞在滑膜组织中的募集和功能,继而抑制滑膜炎症反应,对于OA的临床治疗将具有积极的意义。低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)在临床上使用了二十余年,是一项具有无创,安全性优势的康复物理因子治疗手段,其适应症包括新鲜骨折的保守治疗和骨折不愈的治疗等。目前有临床研究表明LIPUS(频率为1.5 MHz,强度为30 mW/cm~2,占空比为20%)可以缓解OA患者的疼痛,改善其日常生活能力,但相关机制不清楚。近年来,有研究表明LIPUS可以下调体外培养巨噬细胞炎症因子水平,但有关LIPUS对滑膜巨噬细胞功能的调控作用和机制还知之甚少。据此,本课题利用不同的动物模型模拟滑膜炎症反应,并采用体外培养滑膜组织和巨噬细胞等策略,研究了LIPUS对滑膜炎症反应及巨噬细胞的调控作用,并探究了相关的机制。研究方法:第一部分:低强度脉冲超声抑制滑膜巨噬细胞成熟IL-1β产生的机制1.成年小鼠膝关节行DMM手术,并给以LIPUS治疗,在不同的时间点使用Catwalk装置测量小鼠步态变化;2.小鼠膝关节组织切片、染色、组织学评估滑膜病理变化;3.成年小鼠背部皮肤制作空气气囊模型,注射LPS诱导类滑膜炎症反应后LIPUS处理;4.ELISA检测气囊灌注液体中成熟IL-1β含量,染色评估病理变化;5.OA病人滑膜组织切片,免疫荧光染色检测炎症小体组分ASC表达;6.LPS和ATP处理THP-1、Raw264.7细胞以及分离培养的OA病人滑膜组织,LIPUS处理后ELISA检测培养基中IL-1β的含量;7.WB分析LIPUS对活化巨噬细胞炎症小体和细胞自噬相关通路的影响;8.免疫荧光和扫描电镜检测细胞自噬流的变化;9.免疫共沉淀联合质谱分析SQSTM1的相互作用蛋白;10.LPS/ATP处理巨噬细胞模型和DMM小鼠模型分析LIPUS对PKM2的表达变化。第二部分:低强度脉冲超声调控滑膜巨噬细胞极化的机制研究1.HE染色评估LIPUS对DMM小鼠滑膜异常增生的影响;2.免疫荧光分析LIPUS对DMM小鼠膝关节滑膜巨噬细胞极化标志物表达的影响;3.qRT-PCR检测LIPUS对巨噬细胞极化相关标志物的表达影响;4.WB和免疫荧光检测LIPUS对活化巨噬细胞JNK和NF-κB信号通路相关蛋白影响。实验结果:第一部分:低强度脉冲超声抑制滑膜巨噬细胞成熟IL-1β产生的机制1.LIPUS治疗可以促进DMM手术后小鼠异常步态的恢复;2.LIPUS治疗可缓解DMM小鼠术后关节滑膜的炎症反应,减少滑膜巨噬细胞中ASC和IL-1β的表达;3.LIPUS可以缓解LPS诱导的小鼠空气气囊类滑膜炎症反应;4.OA病人滑膜组织中有大量ASC聚集小点表达;5.LIPUS处理可以抑制LPS/ATP处理的巨噬细胞和滑膜组织中成熟IL-1β的产生;6.LIPUS促进LPS/ATP处理巨噬细胞LC3BⅡ的蛋白表达,增加自噬小体的数量,降低SQSTM1蛋白的水平,下调细胞培养上清中剪切形式CASPASE1的蛋白含量;7.LIPUS增强LPS/ATP处理巨噬细胞的自噬流;8.通过IP联合质谱实验表明PKM2和SQSTM1存在与同一个复合体中;9.LIPUS可以加速LPS/ATP处理的巨噬细胞中PKM2蛋白的降解,减少DMM小鼠术后滑膜组织中PKM2阳性巨噬细胞的数量。第二部分:低强度脉冲超声影响滑膜巨噬细胞的极化1.LIPUS治疗可以减少DMM小鼠术后膝关节滑膜组织的厚度;2.LIPUS减少了DMM小鼠滑膜中iNOS阳性巨噬细胞数量,增加了CD206阳性巨噬细胞数量;3.LIPUS可以减少LPS处理后巨噬细胞IL-1β和TNF-α的mRNA水平,增加IL-10和Arg1 mRNA水平;4.LIPUS可下调LPS处理巨噬细胞p-JNK和p-NF-κBp65的蛋白水平,抑制NF-κBp65入核;5.在DMM小鼠的滑膜巨噬细胞中,LIPUS下调了p-JNK和p-NF-κBp65的水平。结论:1.LIPUS可以缓解滑膜炎症反应、抑制巨噬细胞成熟IL-1β产生,相关的机制可能和LIPUS促进巨噬细胞中SQSTM1依赖自噬性降解PKM2蛋白有关;2.LIPUS能抑制滑膜巨噬细胞向M1型极化,促进向M2型极化抑制,机制可能和NF-κB和JNK通路的抑制有关。