椰子胚乳CoFBA的克隆、功能分析及调控机制研究

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椰子(Cocos nucifera L.)是棕榈科椰子属的唯一物种,是热带地区重要的作物。1,6-二磷酸果糖醛缩酶(Fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)是高等植物糖酵解等途径中的关键酶。为了研究椰子中CoFBA基因在胚乳油脂积累过程中的功能以及解析其在油脂代谢通路中的调控机制,实验首先克隆得到了CoFBA基因并在拟南芥中过表达,然后筛选出与其启动子互作的转录因子GATA2,通过载体构建、转基因、脂肪酸提取和EMSA等手段阐明CoFBA的功能及GATA2对CoFBA表达的调控。现已取得如下成果:1.以椰肉RNA为模板,克隆得到CoFBA基因,然后将CoFBA构建到种子特异性启动子napin驱动的pCAMBIA1300s载体中,研究该基因在拟南芥中过表达的影响。选取不同CoFBA转录水平的3个转基因株系进行总油含量和脂肪酸含量分析,与野生型相比,3个转基因株系种子的油脂含量极显著增加(3.5%-18%),而株系之间没有检测到显着性差异。此外,亚油酸(C18:3)和二十烷酸(C20:1)的含量在转基因植物种子中显著增加,表明CoFBA过表达不仅增加了总脂含量,而且改变了转基因株系中脂肪酸的组成。2.以椰子叶片DNA为模板,克隆得到CoFBA启动子pro FBA,序列分析表明该启动子上含有大量顺式作用元件。构建酵母表达载体p HIS-pro FBA,进行酵母单杂实验转椰子c DNA文库,筛选得到转录因子GATA2。将GATA2连接至p35MK1-35S-GFP植物表达载体上进行亚细胞定位实验并发现其定位于细胞核,从而验证其可能具有转录因子活性,可以调控下游CoFBA基因的表达。3.构建蛋白表达载体pCOLD-GATA2并获得纯化蛋白后,通过EMSA验证转录因子GATA2可与pro FBA结合,一对一点板实验验证两者互作。将重组植物表达载体p GreenⅡ62-SK-GATA2顺转入椰子原生质体中,CoFBA表达量下降,即转录因子GATA2抑制CoFBA基因的表达。综上所述,椰子CoFBA基因可以使转基因拟南芥种子中油脂含量增加,并改变其脂肪酸组成;酵母单杂筛选到的转录因子GATA2可以与CoFBA启动子互作并抑制其表达;实验结果为后期研究椰子油脂代谢通路及相关基因分子调控机制提供了可行的思路。
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