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研究背景炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种病因未明的肠道慢性非特异性炎症性疾病,近年来其发病率逐渐升高,IBD不仅严重影响了患者的生活质量,而且加重了家庭及社会的经济负担。为了寻找新的药物靶点以及更好的治疗方法,仍需要进一步深入研究IBD的发病机制。近年来,肥大细胞在IBD发生发展中的作用越来越被重视,主要表现为肥大细胞可以促进肠道炎症反应及破坏屏障功能。然而,肥大细胞在IBD中的具体致病机制尚未完全阐明。外泌体(Exosomes)作为细胞间物质传递及信号转导的重要载体,可由多种类型的细胞分泌,而不同细胞来源的外泌体具有不同的生物学功能。外泌体被受体细胞摄取后,外泌体所携带的mi RNA(Micro RNA)、lnc RNA(Long non-coding RNA)等可调控受体细胞的基因或蛋白表达。研究表明,外泌体在免疫调节中起重要作用,与系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病机制密切相关。多项研究发现,IBD患者血清中的外泌体mi RNA表达水平异常。肠道黏膜屏障作为机体抵抗外来有害物质的重要防线,对于预防IBD的发生及恢复IBD病人的肠道功能具有重要的意义。已有研究表明肥大细胞来源外泌体可促使树突状细胞成熟为抗原递呈细胞,协助炎症反应进行。但有关于肥大细胞影响肠道屏障功能的研究报道不多,而且肥大细胞是否能够通过分泌外泌体及其内部mi RNA参与调节肠道屏障功能也尚未清楚。研究目的本实验拟研究人肥大细胞来源外泌体是否作用于肠上皮细胞,并进一步探讨人肥大细胞来源外泌体携带的mi RNA对肠上皮细胞屏障功能的影响。研究方法(1)利用超速离心法分离得到外泌体,通过透射电镜鉴定外泌体形态及大小。免疫印迹法检测分离得到的外泌体中是否含有标记蛋白CD63及TSG101;检测阴性对照蛋白GM130、Histone及Calnexin表达情况。(2)用荧光染料PKH67标记提取的外泌体,将所得外泌体与Ca CO2、NCM460及HT29细胞共培养24h,再用DAPI对细胞核进行染色,荧光显微镜下观察三种肠上皮细胞中PKH67所标记外泌体的荧光位置。(3)建立了Ca CO2及NCM460两种肠上皮细胞屏障模型,通过酶标仪测定有无外泌体处理下Transwell小室基底部液体OD值的大小来评估外泌体对肠上皮细胞通透性的影响。(4)将外泌体与Ca CO2细胞共培养72h后进行免疫荧光实验观察紧密连接相关蛋白CLDN8、OCLN和ZO-1表达量变化;将外泌体与Ca CO2及NCM460细胞共培养72h后利用免疫印迹法检测紧密连接相关蛋白CLDN8、OCLN和ZO-1表达量变化。(5)将分离得到的人肥大细胞外泌体送公司进行mi RNA芯片检测,检测所得人肥大细胞来源外泌体中mi RNAs的表达情况。(6)将外泌体与HT29细胞共培养72h后用Trizol法提取RNA,利用荧光定量PCR方法检测与外泌体共培养后的HT29细胞中mi RNA的表达水平。(7)用含mi R-223序列的慢病毒Lv-mi RNA-223及对照组慢病毒Lv-mi RNANC感染人肥大细胞,构建并筛选稳定过表达mi R-223的人肥大细胞系,再提取过表达mi R-223人肥大细胞的外泌体与HT29及NCM460细胞共培养72h,DAPI复染。观察绿色荧光(mi R-223)分布情况;利用流式细胞术检测与外泌体共培养后含绿色荧光(mi R-223)的肠上皮细胞数量。(8)将外泌体与肠上皮细胞共培养72h后用mi R-223抑制剂转染肠上皮细胞,然后检测肠上皮细胞中CLDN8表达水平。(9)收集临床IBD患者肠黏膜组织,通过免疫组化检测健康对照组及IBD组肠黏膜组织中肥大细胞免疫表型CD117(c-kit)表达水平。(10)通过荧光定量PCR检测健康对照组、UC组及CD组病人肠黏膜组织中mi R-223表达水平。研究结果(1)透射电镜下观察分离所得外泌体具有典型外泌体形态特征,多为圆形或椭圆形,形似“茶托”,大小约为50-250nm。免疫印迹法结果表明所提取的外泌体中含有CD63及TSG101,不含有GM130、Histone及Calnexin。(2)荧光显微镜下可观察到在Ca CO2、NCM460及HT29三种肠上皮细胞的细胞质中含有大量绿色荧光,成团聚集,表明人肥大细胞来源的外泌体可被肠上皮细胞摄取。(3)与PBS组对比,加入外泌体处理后Transwell小室基底部液体OD值变大。而且Ca CO2及NCM460两种肠上皮细胞屏障模型的OD值变化趋势一致,由此表明人肥大细胞外泌体被肠上皮细胞摄取后使肠上皮细胞通透性增加。(4)免疫荧光及免疫印迹法结果显示与对照组相比,外泌体处理后Ca CO2细胞的紧密连接蛋白Claudin8、Occludin和ZO-1表达量下降。(5)mi RNA芯片检测结果显示包括mi R-223、mi R-21、mi R-16等在内的一系列mi RNAs在人肥大细胞来源的外泌体中高表达。(6)荧光定量PCR结果提示外泌体可能作为人肥大细胞与HT29细胞之间介导mi RNA转移的载体。(7)荧光显微镜下可观察到带绿色荧光(mi R-223)的外泌体位于HT29及NCM460细胞的胞质中,提示人肥大细胞外泌体中含mi R-223且被肠上皮细胞摄取;流式细胞术分析显示与PBS组相比,外泌体处理组中的肠上皮细胞摄取了带mi R-223的外泌体。(8)转染mi R-223抑制剂后可缓解外泌体对紧密连接蛋白CLDN8的抑制作用。(9)与健康对照组相比,IBD患者肠黏膜组织中肥大细胞数量增多。(10)与健康对照组相比,UC组及CD组肠黏膜组织中mi R-223表达量增加。结论人肥大细胞来源外泌体中的mi R-223通过抑制肠上皮细胞中紧密连接蛋白CLDN8表达从而破坏肠道屏障功能。