论文部分内容阅读
人急性早幼粒白血病NB4细胞是来源于急性粒细胞白血病患者的传代细胞系，是研究此类疾病机制的较理想的模型。本实验室大量的前期工作证明亚硒酸钠在一定浓度和作用时间下能诱导NB4细胞凋亡。本文诣在从活性氧以及活性氧对细胞内PKC磷酸化及切割的调节入手，进一步研究亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的调控机制。从而为亚硒酸钠的临床应用提供有价值的理论依据。活性氧（reactive oxygen species，ROS）ROS是一类O2的部分还原的代谢产物，由于具有比O2更强的反应性而得名，主要包括过氧化氢和超氧化物阴离子。本文利用活性氧特异的荧光探针证明了亚硒酸钠可以刺激细胞产生活性氧，且活性氧的产量与亚硒酸钠的作用时间成线性关系。此外，长时间亚硒酸钠处理可以抑制锰超氧化物歧化酶基因的表达，而锰超氧化物歧化酶是细胞内清除活性氧的主要酶类。使用一种特效的公认的抗氧化剂，即可透膜的锰超氧化物歧化酶拟晶（MnTmPy）预处理细胞，在很大程度上抑制了亚硒酸钠的促凋亡作用。而由此认为活性氧是亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的执行者。进而研究了ROS诱导NB4细胞凋亡的具体机制。首先，发现蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族成员中各主要成员的磷酸化和切割受到亚硒酸钠不同程度的调节。其中亚硒酸钠处理可以引发PKCα和PKCδ的磷酸化和切割。而磷酸化和切割是PKC被激活的标志。更重要的是ROS的产生和PKC的磷酸化和切割有着因果关系。抗氧化剂预处理可以明显抑制亚硒酸钠引起的PKC的激活。其次，发现亚硒酸钠引起的线粒体膜电位丧失也是由活性氧介导的，因为抗氧化剂预处理几乎完全阻止了跨膜电位的丧失。抗氧化剂同时抑制了亚硒酸钠引起的Bid蛋白的切割，提示切割Bid可能是活性氧激活线粒体凋亡通路的机制。再次，caspase3抑制剂可以抑制亚硒酸钠诱导的凋亡过程中PKC的切割，由此推测ROS引发的线粒体凋亡途径激活了Caspase3，后者通过切割PKC加强了PKC的活性。最后，为进一步验证PKC在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡中的作用。使用了PKC抑制剂GF294003和PKC激活剂TPA，发现PKC抑制剂可以部分抑制亚硒酸钠诱导的凋亡而激活剂可以加强凋亡。综合上述研究结果，认为亚硒酸钠处理在短时间内诱导NB4细胞产生活性氧，活性氧引起Bid蛋白的切割，从而导致线粒体膜电位的丧失，进而激活caspase3。激活的caspase3切割PKC产生PKC活性片断，起到了激活PKC的作用。活性氧同时通过促进PKC的磷酸化来上调PKC的活性。依据最新文献报道，ROS可以与磷酸酶的活性中心反应使磷酸酶失活，打破细胞内磷酸化与去磷酸化的平衡，推测磷酸酶的失活是PKC磷酸化增加的原因之一。且近期许多研究表明PKCδ的切割片断可以诱导多种肿瘤细胞凋亡。因此，亚硒酸钠诱导产生活性氧，后者激活PKC，引发一系列下游信号转导事件，是亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的重要机制之一。