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目前,心脑血管疾病是世界发病率最高的疾病之一,其致死、致残率高居各类疾病之首。其中,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发生是心脑血管疾病的主要病理基础。脂质代谢紊乱尤其是胆固醇代谢紊乱是目前公认的主要致病因子。调脂药物的早期研究主要集中于针对低密度脂蛋白受体(low densitylipoprotein receptor,LDLR)通路,他汀类药物是其代表药物,具有出色的降胆固醇疗效,可明显降低心脏病及卒中的风险。但是他汀类药物总的有效率仅为20～40%,因此,心血管疾病远未解决,亟需发现新作用机制的药物。近年来,在新型调脂药物研发过程中,血浆脂蛋白代谢过程中的另两个关键步骤:胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT)通路及泡沫细胞形成(foam cellformation)过程受到越来越多的关注。本论文围绕着这两个方面开展了相关药物筛选和作用机制研究。高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)是胆固醇逆向转运中最主要的胆固醇携带者,在这一过程中,B族I型清道夫受体SR-BI(人的同源基因命名为CLA-1)发挥了重要作用。作为HDL的受体,SR-BI参与调节肝脏对脂质的选择性摄取,介导HDL胆固醇酯选择性进入细胞;另外,在外周细胞,SR-BI能通过结合HDL促进胆固醇的外流。由于SR-BI在RCT的起始及终末步骤中都发挥了重要作用,因此被认为是抗动脉粥样硬化药物的潜在靶点之一。本研究室构建了基于细胞的高密度脂蛋白受体表达上调剂高通量筛选模型,对化合物及微生物次级代谢产物进行了大规模筛选,其中阳性菌株04-9179可有效上调CLA-1启动子的活性,从该菌株发酵液中分离得到阳性化合物9179A及阳性组分B和C。本论文第一部分针对CLA-1表达上调剂9179A进行结构确证,活性检测及相关分子作用机制研究。在前期工作基础上,经化学及生物学分析进一步确证,9179A为已知化合物Trichostatin A。检测9179A对人肝癌细胞HepG2及小鼠巨噬细胞RAW 264.7中CLA-1/SR-BI表达水平的影响,结果表明9179A可分别上调HepG2及RAW 264.7中CLA-1/SR-BI mRNA及蛋白水平。在此基础上,进一步检测9179A对HepG2和RAW 264.7细胞的脂质摄取能力以及RAW 264.7细胞胆固醇外流能力的影响,结果表明,9179A可上调HepG2细胞和RAW 264.7细胞对DiI-HDL的摄取,还可上调RAW 264.7细胞的胆固醇外流能力。对9179A分子作用机制的进一步研究提示,9179A可能通过调控含有SRE/SP1等顺式元件的启动子区域发挥上调CLA-1/SR-BI转录的作用。此外,我们还对阳性菌株04-9179中阳性组分B和C进行了分离纯化、结构鉴定和活性测定,结果表明,化合物9179B和9179C对CLA-1启动子活性的上调作用较低。细胞泡沫化是AS形成的关键步骤。巨噬细胞上存在的清道夫受体A(SR-A)和B族清道夫受体CD36可导致oxLDL被细胞无限制摄取(即在摄取时不受负反馈调控),因此它们在泡沫细胞形成中发挥重要作用。体内、外研究显示,60～90%的巨噬细胞泡沫化是由CD36介导的。因此CD36被认为是抗动脉粥样硬化药物的潜在靶点之一。在本论文第二部分中,我们在大肠杆菌中成功表达了重组CD36可溶性受体蛋白,并以此为靶点建立了CD36拮抗剂高通量筛选模型。分别扩增人CD36全长及可溶性片段(sCD36)cDNA,将它们克隆至pGEM-T载体并测序,分别与大肠杆菌表达载体pET-30a(+)连接,构建CD36及sCD36的重组表达质粒,并将重组质粒分别转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),表达目的蛋白。经SDS-PAGE及Western Blot检测获得成功表达sCD36的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET-sCD36。该菌株表达的sCD36蛋白经配基结合实验及油红O染色实验证实具有配基结合活性。随后,利用该重组蛋白建立并优化了基于受体-配基竞争性结合的ELISA-like高通量药物筛选模型,并应用此模型筛选化合物640个。其中,具有抑制CD36配基结合活性的阳性化合物27个,阳性率为4.22%。对部分阳性化合物进行了活性验证,结果显示,受试化合物在细胞水平上具有抑制RAW 264.7细胞摄取oxLDL及DiI-acLDL的能力,进一步证实了构建模型的可行性。