禽流感病毒是危害当前养禽业的重要病原,它不仅给家禽业造成巨大的经济损失,还由于人畜共患引发一些公共卫生安全事件,因此有效防控禽流感发生已成为家禽业健康生产中迫切需要解决的问题之一。研究已发现鸭对流感病毒敏感性显著低于鸡,主要原因在于鸭可依托体内特有的RIG-I信号通路的激活发挥抗病毒效应。在免疫信号通路中泛素化修饰广泛存在,其不仅调节细胞内多项生理功能,还参与调控多种病毒的复制与增殖过程。TRIM25（tripartitemotifcontaining25）作为E3泛素连接酶,鸭TRIM25泛素化可否介导RIG-I信号通路参与抗病毒效应调控,其作用机理尚不清楚。基于此,本研究利用5’pppdsRNA体外模拟禽流感病毒感染鸭胚胎成纤维细胞（DEFs）,通过泛素化蛋白质组学技术结合免疫共沉淀（Co-IP）对鸭TRIM25介导泛素化对RIG-I信号通路调控机制研究,旨在揭示鸭RIG-I信号通路关键分子调控免疫应答的分子机制及其作用机理,为揭开鸭病毒特异性清除机制和禽流感防控提供新的思路。主要研究内容如下:1.禽流感病毒模拟物体外感染对鸭RIG-I信号通路蛋白泛素化修饰的影响为探明鸭感染禽流感病毒对RIG-I信号通路蛋白泛素化修饰的影响,采用5’ppp dsRNA模拟禽流感病毒体外感染,Western Blot检测发现5’ppp dsRNA刺激后总泛素化水平发生显著变化,同时RT-qPCR结果显示RLRs（RIG-I、MDA5、LGP2）和免疫炎症因子（包括IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-2）mRNA水平显著上调。为进一步筛选5’ppp dsRNA感染DEFs的泛素化修饰关键蛋白,利用Label-free技术,结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛选到943个差异表达的泛素化蛋白（446个泛素化蛋白显著上调,497个泛素化蛋白显著下调）和1566个差异表达的泛素化位点（754个泛素化位点修饰显著上调,812个泛素化位点修饰显著下调）,含35种泛素化修饰的motif元件。通过生物信息学技术对存在显著差异修饰蛋白进行亚细胞定位、生物学功能、KEGG代谢通路等分析,发现修饰显著差异蛋白与蛋白酶体降解、蛋白定位以及能量代谢等多种生物进程相关,其中5’ppp dsRNA激活的参与RIG-I信号通路有8种蛋白（TRIM25、MAVS、USP14、UBE2N、DDX3X、RAD23A、MEX3C、EFTUD2）发生显著泛素化修饰改变,包含17个泛素化修饰位点。进一步采用TMT技术验证5’ppp dsRNA感染后上述蛋白表达水平变化,发现这8种泛素化修饰蛋白均未发生显著表达变化,表明在鸭抗病毒感染中泛素化修饰而不是蛋白本身表达的改变发挥了关键作用。2.鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用为探讨鸭TRIM25泛素化调控抗病毒作用,在获取鸭TRIM25的cDNA全长序列（GenBank登录号:KY974316）基础上,并对duTRIM25组织表达谱进行了检测。结果发现duTRIM25包含一个RING结构域,2个B-Box结构域和1个SPRY结构域。组织表达谱结果显示duTRIM25在肾脏、肝脏和肌肉中高度表达,而在十二指肠和卵巢中表达量相对较低。为进一步探讨TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用,通过构建TRIM25真核表达载体及合成TRIM25干扰小RNA,分别检测了过表达和敲低TRIM25对RIG-I信号通路调控的影响。免疫共沉淀结合Western Blot检测TRIM25泛素化水平变化,结果表明,在5’ppp dsRNA刺激下,过表达duTRIM25,其泛素化水平显著提高,同时采用双荧光素酶报告基因系统和ELISA发现IRF1和NF-κB的含量及IFN-β的转录活性显著增强,而敲低duTRIM25则表现出相反趋势。RT-qPCR检测结果发现,过表达 duTRIM25 能介导 RIG-I 信号通路上的 IFN-β、IRF1、NF-κB、RIG-I、MAVS、FADD、TRAF2及TBK1基因表达量显著上调,而内源性敲低duTRIM25则下调上述基因的表达。因此说,在5’pppdsRNA刺激下,鸭TRIM25可介导泛素化调节RIG-I信号通路抗病毒作用。3.鸭TRIM25泛素化介导RIG-I信号通路调控抗病毒作用机制为了进一步阐明TRIM25泛素化激活RIG-I信号通路中的抗病毒作用机制,鉴于泛素化连接存在K48-连接（蛋白酶体降解）和K63-连接（DNA损伤修复、NF-κB通路调节等过程）两种形式,我们首先发现5’ppp dsRNA刺激能够促进TRIM25发生K63-连接的泛素化修饰,提示TRIM25泛素化修饰可激活下游信号传导。为了进一步证实TRIM25泛素化修饰的激活机制,利用定点突变技术对前期泛素化蛋白质组学结果中TRIM25泛素化修饰差异显著的赖氨酸位点（K263、K2 76、K281和K293）进行突变,分别构建TRIM25不同突变位点的表达载体（K263R、K276R、K281R和K293R）,免疫共沉淀结合Western Blot检测发现经5’ppp dsRNA刺激TRIM25 K276R和K293R显著降低其泛素化水平。因此说,在5’pppdsRNA刺激下,鸭TRIM25可通过K276和K293位点泛素化激活RIG-I信号通路参与抗病毒作用调控。综上,在5’pppdsRNA刺激下,鸭TRIM25泛素化可介导RIG-I信号通路促进IFN-β表达,并依托TRIM25 K276和K293位点泛素化激活发挥了抗病毒作用,研究结果阐明了鸭TRIM25泛素化介导的RIG-I信号通路调控分子机制。