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研究背景与目的:肾去交感神经术（Renal denervation,RDN）是通过导管射频消融及超声消融阻断肾动脉交感神经的传导而降低动脉血压的一种有创治疗手段。近年来,大量的临床试验研究数据已证实RDN可有效降低患者动脉血压;但RDN不仅存在肾动脉狭窄、动脉瘤及出血等并发症,而且其有严格的肾动脉解剖学要求。据研究发现在高血压人群中仅有50%左右达到行RDN治疗的基本要求。因此,研发一种无创、广谱及有效的RDN治疗方式具有重要的意义。长春新碱（Vincristine,VCR）是一种常规的化疗药物,其主要副作用为神经毒性。既往研究表明利用新型导管于肾动脉内局部注射VCR可成功实现肾去交感化,因此,VCR可被用作肾去交感化可选的药物。超声微泡是一种具有生物兼容性并能显著增强超声成像效果的造影剂,并且目前已成为优于慢病毒及质粒的基因和药物载体。国内外许多学者在应用生物素-亲和素系统、碳二亚胺法及静电吸附法等方法制备特定的超声微泡以增强靶器官或组织的显影效果的同时,联合超声靶向技术精准投递药物已广泛用于肿瘤、血栓及心血管疾病等领域。肾动脉神经髓鞘细胞（Schwann cell）表达丰富的P0蛋白,因此,理论上经P0蛋白修饰的超声微泡能够高效的与外周神经髓鞘细胞结合,同时利用超声靶向释放技术,可明显增加局部靶组织的药物浓度,从而减少对非靶区组织的毒性作用。因此,本论文结合上述假设制备了一种能与外周神经髓鞘细胞特异性结合的靶向载VCR超声微泡,并检测其理化性质;在细胞及组织水平上探讨抗髓鞘P0蛋白修饰载VCR超声微泡联合超声对Schwann细胞凋亡及大鼠肾动脉交感神经组织的影响;为实现分子靶向药物的肾去交感化治疗恶性高血压提供新的科研思路。材料与方法:1.制备靶向载药超声微泡并检测其理化性质:采用薄膜水化-机械振动法制备普通超声微泡（MBs-O2和MBs-C3F8）和载VCR超声微泡（VCR-MBs）,通过生物素-亲和素系统实现VCR-MBs与生物素化P0抗体的偶联得到靶向载药超声微泡（VCR-TMBs）。在显微镜下观察MBs、VCR-MBs、VCR-TMBs的形态、大小、分散度及均一性;采用免疫荧光法检验超声微泡及VCR-TMBs的成功率情况;将不同超声微泡放置4℃和室温（25℃）条件下,通过自动计数仪测量0.5 d、1 d、3 d、5 d、1周、2周、3周及1月时它们的浓度,测定不同超声微泡的稳定性;在多普勒超声仪探头下观察不同超声微泡的体外显影效果,并通过Photoshop软件对显影图像灰阶值亮度进行分析（K%越高提示显影效果越差）;HPLC法检测VCR-TMBs的包封率和载药量。2.靶向载药超声微泡体外寻靶实验:采用免疫荧光法验证Schwann细胞表达P0蛋白;利用共聚焦显微镜观察VCR-TMBs体外寻靶能力。采用CCK-8法检测不同浓度的VCR及不同时间对Schwann细胞活力的影响,从而寻找药物最佳作用浓度及时间;分别在细胞及组织水平进行分组:正常组、VCR组、US组、VCR+US组、MBs+US组、TMBs+US组、VCR-MBs+US组、VCR-TMBs+US组;在倒置显微镜下观察各实验组细胞形态变化,进而采用CCK-8法检测各组细胞活力、流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率及机械损伤率。体外培养正常SD大鼠肾动脉,经不同处理后,采用HE（Haematoxylin–eosin）染色观察各组中肾动脉周围神经的变化。结果:1.通过薄膜水化-机械振动法成功制备超声微泡,各种超声微泡宏观均为乳白色悬浮液,使用C3F8气体制备超声微泡较氧气制备的超声微泡更纯白、更浓稠;与氧气制备的超声微泡相比,C3F8气体制备超声微泡粒径显著缩小（P＜0.05）,并且体外显影图像效果明显增强（P＜0.05）,3 min后仍可维持较高水平;说明C3F8惰性气体制备的超声微泡质量优于氧气制备的超声微泡。2.DiI（红色）标记VCR-MBs的脂质壳,FITC-Ig G二抗（绿色）标记VCRTMBs表面的P0蛋白抗体,在免疫荧光显微镜下观察绿光靶向抗体与红光脂质壳分布一致,表明P0抗体已成功连接VCR-MBs,提示VCR-TMBs制备成功,并且成功率较高;在显微镜下观察MBs、VCR-MBs、TMBs及VCR-TMBs均呈圆形,分布均匀,大小均一,平均粒径分别为3.22±1.067μm、3.73±1.196μm、3.34±0.871μm、3.22±0.793μm,差异无统计学意义（P＞0.05）;将MBs、VCR-MBs和VCR-TMBs放置在4℃和室温中保存,普通MBs和VCR-MBs均在第5天浓度显著下降（P＜0.01）,VCR-TMBs均在第3天浓度显著下降（P＜0.01）;MBs、VCR-MBs放置5 d后和VCR-TMBs放置3 d后光镜下观察可维持原有的形态,但有明显聚集现象;说明超声微泡稳定性与粒径、温度无关,且本实验制备的VCR-TMBs稳定性较MBs、VCR-MBs稍差。3.根据VCR标准溶液浓度梯度制定标准曲线,得回归方程为:Y=17871 X-6343,r=0.9999。表明VCR浓度在0.1～100μg/m L范围内与峰面积具有良好的线性关系;并且根据HPLC法测定VCR-TMBs的包封率及载药率分别是82.90±9.98%、2.07±0.25%。4.外周神经髓鞘细胞（Schwann细胞）膜上表达P0蛋白;激光共聚焦显微镜镜下可见DiI标记（红色）的VCR-TMBs聚集在Schwann细胞周围,而DiI标记VCR-MBs散在分布细胞之间。在细胞水平上说明VCR-TMBs具有一定的寻靶能力。5.随着VCR浓度增加和作用时间延长,Schwann细胞活力均下降、凋亡率增加,CCK8及流式细胞检测结果均提示VCR最佳浓度为10μg/m L,最佳时间为24小时,但细胞凋亡率仅为13.50±1.899%;经不同实验组处理后发现,VCR+US组、VCR-MBs+US组、TMBs+US组及VCR-TMBs+US组细胞形态变圆,变亮,悬浮细胞依次增多,细胞数也逐渐减少;VCR-TMBs+US组与VCR组、VCR+US组及VCR-MBs+US组比较,细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。说明10μg/m L VCR促进细胞凋亡能力较弱,而VCR-TMBs+US可显著提高VCR的促凋亡作用。与正常组比较,US组细胞机械损伤率明显增加（P＜0.05）;TMBs+US组细胞损伤率显著高于US组、MBs+US组（P＜0.01）;说明TMBs可增强US的机械损伤作用。6.肾动脉组织切片HE染色结果分析显示,VCR+US组、TMBs+US组髓鞘可见轻度损伤,而VCR-TMBs+US组肾动脉神经除了髓鞘损伤外,还可见其髓鞘细胞及部分神经细胞变性（细胞成空泡样改变）;在体外组织水平说明VCRTMBs较单纯VCR或TMBs联合US对肾交感神经损伤作用强。结论:1.成功制备靶向载药微泡VCR-TMBs,其具有粒径小、分布均匀、体外显影图像短期效果较好、包封率高的特点,但可能抗体分子量大的原由,其稳定性较MBs及VCR-MBs稍差。2.在细胞水平,靶向载药微泡VCR-TMBs可与外周神经髓鞘Schwann细胞靶向结合;VCR-TMBs联合超声可放大药物对细胞的促凋亡作用,并使肾动脉神经组织髓鞘细胞变性和脱髓鞘改变。