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活性氧（ROS）是细胞代谢的正常产物,但过量的ROS会引起细胞的氧化损伤。甜菜碱是广泛存在于动植物中的一种生物碱,具有多种生理调控功能,但其抗氧化作用调控机制研究较少。Wnt/β-catenin信号通路参与了胚胎发育、免疫、代谢、细胞凋亡、坏死等调控过程,与ROS之间关系密切。本课题拟研究Wnt/β-catenin通路参与甜菜碱调控斑马鱼ZF4细胞ROS水平的机制,从细胞水平研究甜菜碱对斑马鱼细胞内ROS的调控机制,为鱼类和水产相关研究提供理论参考依据。论文具体研究结果如下:（1）研究了甜菜碱对斑马鱼ZF4细胞内ROS水平的影响。以不同浓度的甜菜碱处理ZF4细胞24小时,采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测甜菜碱对ZF4细胞增殖率的影响,发现0.01～100 m M的甜菜碱对ZF4细胞均有显著增殖作用。进一步采用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）标记细胞内总ROS,经荧光酶标仪检测和激光共聚焦显微镜观察,发现甜菜碱处理对细胞内总ROS水平无显著性影响。采用试剂盒检测细胞内各种ROS和抗氧化酶活力,发现甜菜碱处理显著减少细胞内过氧化氢（H2O2）含量,并显著提高过氧化氢酶（CAT）活力。采用实时荧光定量PCR（q PCR）技术检测相关基因的表达水平,发现甜菜碱可以显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和CAT的基因表达水平。结果表明甜菜碱对正常培养的ZF4细胞有一定的抗氧化性作用。（2）研究了甜菜碱对斑马鱼ZF4细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。以10 m M的甜菜碱处理ZF4细胞24小时,q PCR检测发现10 m M甜菜碱可以显著促进细胞内Wnt8a和PPARγ基因表达量,显著抑制Wnt3a、Wnt10b和GSK-3β基因的表达量。采用Western blot技术检测发现甜菜碱可以显著抑制GSK-3β和p-β-catenin（Ser33）蛋白表达量,显著促进β-catenin蛋白表达量。进一步采用细胞免疫荧光技术观察β-catenin蛋白在细胞内的分布,发现甜菜碱可以促进β-catenin蛋白的表达,并出现β-catenin蛋白在细胞核周围积聚的现象。结果表明甜菜碱在正常培养的ZF4细胞中激活了Wnt/β-catenin信号通路,该通路可能促进ZF4细胞的增殖。（3）构建了斑马鱼ZF4细胞氧化应激模型。为更好的研究甜菜碱在ZF4细胞中的抗氧化作用,我们采用50μM的过氧化氢处理ZF4细胞24小时,发现过氧化氢处理ZF4细胞后,细胞存活率为对照组的76%～86%;细胞内ROS荧光强度比正常ZF4细胞提高26%;细胞内H2O2含量增高34%,抗超氧阴离子（O2.-）能力下降14%,抑制羟自由基（·OH）能力下降14%;细胞内CAT酶活力下降11%,SOD酶活力下降9%,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力下降16%。因而,通过向斑马鱼ZF4细胞内加入50μM的过氧化氢,成功构建了斑马鱼ZF4细胞的氧化应激模型。（4）研究了甜菜碱对斑马鱼ZF4细胞氧化应激模型内ROS水平和Wnt/β-catenin信号通路的影响。我们采用0.1～70 m M甜菜碱处理ZF4细胞氧化应激模型,发现1～70m M甜菜碱均可以显著降低ZF4细胞氧化应激模型中的ROS水平。当甜菜碱浓度为10 m M时,ZF4细胞内的ROS水平降低了20%。因而,我们进一步采用10 m M甜菜碱进行后续实验,发现甜菜碱处理后,细胞内H2O2含量显著降低15%,抑制·OH的能力显著提高14%;并且10 m M甜菜碱显著提高细胞内CAT和SOD的基因表达量和酶活力。另外,我们进一步对Wnt/β-catenin信号通路相关分子进行基因和蛋白水平检测,发现甜菜碱在ZF4细胞氧化应激模型中显著促进了GSK-3β基因和蛋白的表达,显著抑制β-catenin基因和蛋白的表达,显著促进p-β-catenin（Ser33）蛋白的产生,并减少了β-catenin蛋白在细胞核周围积聚的现象,诱导PPARγ基因的表达。研究结果表明甜菜碱在ZF4细胞氧化应激模型中具有良好的抗氧化作用,并且甜菜碱在该模型中对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用。（5）研究了甜菜碱对过表达β-catenin细胞氧化应激模型ROS的影响。为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路与甜菜碱抗氧化作用之间的关系,我们构建了p EGFP-N1-β-catenin真核表达载体,用脂质体lipo2000转染ZF4细胞,添加10 m M甜菜碱,进一步采用50μM过氧化氢处理细胞24小时。研究发现过表达β-catenin后,PPARγ、SOD和CAT基因表达量显著下降,这表明β-catenin在甜菜碱抗氧化作用中具有重要作用。综上所述,甜菜碱对正常培养的ZF4细胞总ROS无显著性影响,但在ZF4细胞氧化应激模型中具有显著的抗氧化作用。研究结果表明甜菜碱可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,促进PPARγ、SOD和CAT的基因表达水平,从而发挥抗氧化作用。