【摘 要】
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目的观察载三联抗结核药物PA-824、莫西沙星、吡嗪酰胺（Pa Mz）和人形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein 2,BMP-2）的3D打印纳米羟基磷灰石（nanoHydroxyapatite,nHA）抗结核人工骨在体外对兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs）的成骨分化和细胞粘附能力的影响,以评价骨髓间充
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目的观察载三联抗结核药物PA-824、莫西沙星、吡嗪酰胺（Pa Mz）和人形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein 2,BMP-2）的3D打印纳米羟基磷灰石（nanoHydroxyapatite,nHA）抗结核人工骨在体外对兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs）的成骨分化和细胞粘附能力的影响,以评价骨髓间充质干细胞与抗结核人工骨的相容性和体外成骨性能。方法通过3D打印制备负载三联抗结核药物PA-824、莫西沙星、吡嗪酰胺的3D复合支架;利用刮浆法将人形态发生蛋白-2缓释微球附着在支架上,制备成拟兼具成骨和抗菌性能的人工骨。采用全骨髓贴壁培养法获取并纯化兔骨髓间充质干细胞,并使用流式细胞术、成骨、成脂染色进行细胞鉴定;将骨髓间充质干细胞同各组人工骨复合培养1、3、7、14、21天后,各时间点分别采用CCK-8法观察三组细胞增殖情况,以评价材料的细胞毒性;以钙结节沉积程度及碱性磷酸酶表达活性评价骨髓间充质干细胞成骨分化效果,RT-PCR和Western blot检测成骨相关基因和蛋白表达水平;采用扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在复合人工骨表面的附着和增殖情况,以显示其粘附特性。结果采用前期成功制备含PA-824、莫西沙星、吡嗪酰胺、聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合支架,将人形态发生蛋白-2缓释微球附着在其表面,该支架程乳白色,质硬而表面粗糙,扫描电镜观察到人形态发生蛋白-2微球表面附着良好,支架空间结构完整,空隙连通;分离并纯化兔骨髓间充质干细胞,第7天见其形态为短梭形纤维样梭形、旋涡状生长,状态良好;流式细胞术检测结果显示CD29和CD44阳性高表达,CD45和CD90表达阴性,表明细胞为骨髓间充质干细胞;采用成脂诱导分化培养细胞,7天可见脂滴生成,油红O染色阳性,采用成骨诱导分化培养细胞,21天可见钙结节生成,茜素红染色阳性,进一步证明该细胞为骨髓间充质干细胞;细胞毒性实验结果显示,各组骨髓间充质干细胞增值状态良好,实验组和阳性对照组骨髓间充质干细胞较空白对照组增殖活性更明显（P<0.05）,但前14天实验组和阳性对照组比较细胞增殖无差别（P>0.05）,证实PaMZ/BMP-2/nHA复合人工骨无毒;三组碱性磷酸酶活性结果显示,各时间点空白对照组较实验组和阳性对照组碱性磷酸酶活性低,比较有明显的统计学差异（P<0.05）,但实验组和阳性对照组比较差异不明显（P>0.05）。茜素红染色结果表明,PaMZ/BMP-2/nHA人工骨和BMP-2均可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且有钙结节沉积;RT-PCR和Western blot检测发现,Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白的表达在实验组和阳性对照组表达更加明显,结果进一步证实PaMZ/BMP-2/nHA人工骨的促成骨分化能力;14天扫描电镜见细胞在支架上呈长梭形,形态饱满,均匀分布,21天时观察到其在支架上紧密黏附,且呈“八爪”状或长梭形生长。结论载PaMZ/BMP-2的nHA抗结核人工骨体外具有良好的生物相容性,能促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化,可望成为理想的骨组织工程材料。
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