黄花棘豆的迅速蔓延严重的破坏了草原生态多样性,进而对草原的生态平衡造成影响。因此,探究其蔓延机理显得尤为迫切。黄花棘豆的迅速蔓延与其极强的抗逆性息息相关,但目前研究主要集中在分布与灾害调查、化感作用、中毒机理及药用价值研究等方面,尚未有相关抗逆机理研究。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物响应逆境胁迫的一类重要蛋白,具有保护植物组织免受水分胁迫伤害的功能。本课题组前期研究也显示LEA基因在胁迫处理下显著上调表达。因此,本研究拟以黄花棘豆LEA3基因为研究目标,对其进行基因克隆、生物信息学分析、转录水平表达分析、功能分析等方面的研究,以明确Oo LEA3基因在黄花棘豆响应逆境胁迫中的作用机制,为解析黄花棘豆蔓延的内在机制提供依据,同时也为研究植物抗旱育种提供新思路和方法。主要研究内容及结果如下:1.从本课题组已有的转录组数据中获得相关序列,利用Primer软件设计特异引物,成功克隆到该基因,命名为Oo LEA3(MH295742)。Oo LEA3基因全长640 bp,开放阅读框为522 bp,编码173个氨基酸。生物信息学分析显示,Oo LEA3蛋白为亲水性蛋白,没有信号肽结构和剪切位点,不存在跨膜结构域,有多个磷酸化和糖基化位点。和已知LEA3家族蛋白比对发现,Oo LEA3蛋白含有4个高度保守的重复基序(TAQAAKDKTQQ),为典型的LEA3家族蛋白。进化树分析显示Oo LEA3蛋白地三叶草的亲缘关系最近,与鹰嘴豆和蒺藜苜蓿的亲缘关系次之。2.利用q RT-PCR方法分析了Oo LEA3基因在干旱、高盐、低温三种胁迫处理以及脱落酸、乙烯、赤霉素三种激素处理下的转录水平的表达特征,结果显示:干旱、高盐、低温非生物胁迫均可显著诱导Oo LEA3基因的表达;在激素处理下,Oo LEA3基因受脱落酸高效诱导表达,而乙烯和赤霉素处理对Oo LEA3基因的表达影响不显著。该结果表明,Oo LEA3基因可能参与了依赖ABA的信号通路,并通过该信号通路响应黄花棘豆对非生物胁迫的抗性反应。3.构建Oo LEA3基因的原核表达重组载体p ET32a-Oo LEA3,转化大肠杆菌BL21star(DE3),经IPTG诱导表达。对含p ET32a-Oo LEA3重组质粒的大肠杆菌和对照菌(含p ET32a空载体)进行山梨醇渗透胁迫处理,观察大肠杆菌在胁迫条件下的菌斑形态变化和生长曲线的测定。结果显示,表达了Oo LEA3蛋白的重组菌株在胁迫条件下,其菌斑显著大于对照菌株,生长状态也优于对照菌株,表明黄花棘豆LEA3蛋白参与大肠杆菌的抗渗透反应。4.在体外研究了Oo LEA3蛋白在反复冻融和脱水胁迫下对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性及聚集率的影响。结果显示,加入Oo LEA3蛋白的LDH酶活显著高于对照,且在待测蛋白与LDH体积比为20:1时,其活性保留达最大值,保留率在80%以上,同时,在此比例下Oo LEA3蛋白存在时LDH的聚集率明显降低。表明Oo LEA3蛋白在冻融和脱水胁迫下能够降低LDH的聚集率进而保护LDH酶活性。5.构建Oo LEA3基因的真核表达重组载体p REP3X-Oo LEA3,转入酵母Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)中。对重组的S.pombe(p REP3X-Oo LEA3)和对照菌S.pombe(p REP3X)进行山梨醇渗透胁迫处理,观察粟酒裂殖酵母在处理后的菌斑形态的变化和生长曲线的测定。结果显示,粟酒裂殖酵母S.pombe(p REP3XOo LEA3)在受到渗透胁迫时,其菌斑明显大于对照菌S.pombe(p REP3X),生长趋势也优于对照菌株,表明Oo LEA3蛋白能够提高粟酒裂殖酵母的抗渗透能力。6.通过农杆菌介导的蘸花法浸染转化拟南芥(Col-0),转基因植株经含有潮霉素的1/2MS培养基中筛选及DNA水平、转录水平以及蛋白水平进行鉴定,获得T3代阳性转基因植株,并测定其抗性指标。