糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）是一种常见的糖尿病微血管并发症。随着全球糖尿病发病率的持续上升,DKD的发病率在全球范围内呈上升趋势,是引起终末期肾脏疾病的主要原因。因此,积极防治DKD的发生发展是现代医学的重点和难点。现代医学对于DKD的治疗尚缺乏有效办法。如何在DKD早期进行有效的治疗,延缓DKD进展,保护肾功能,是当前研究的热点。在DKD的进展中,机体微循环、肾小球及球内细胞发生着各种病理改变。近年来,随着科学技术的发展和足细胞系的建立,越来越多的研究显示,随着DKD严重程度的增加,肾脏微循环障碍、足细胞形态功能的诸多变化和损伤,与DKD尿白蛋白密切相关。长期的临床实践及相关研究均表明,中医药具有多靶点、多途径干预疾病的特点,能够发挥整体调控和协同效应,为DKD的防治提供新的手段和策略。导师根据多年治疗DKD的临床经验,提出益气、活血、通络的诊疗思路。课题组前期回顾性分析导师运用益气活血通络法治疗的DKD病例,初步显示了该治法的有效性和安全性。因此,本论文在前期研究的基础上,挖掘益气活血通络法代表方的核心药物,并探讨其作用机制,以期为导师在“治未病”和“络病”理论指导下,提出的益气活血通络法治疗DKD的学术思想提供科学依据。目的挖掘导师运用益气活血通络法治疗DKD的代表方（肾浊方）核心药物组成,并探究肾浊方的物质基础,及其治疗DKD可能的作用靶点、潜在作用机制。方法1临床研究部分1.1筛选纳入2006年6月至2021年9月期间就诊于中国中医科学院广安门医院仝小林院士门诊的DKD（2型糖尿病肾脏疾病）患者。对导师近15年临床治疗的DKD医案进行整理,录入DKD患者初诊病历信息,或者2型糖尿病患者随着病情进展,发展为DKD的首次诊疗病历信息。1.2根据《中医内科学》、《诊断学》、《中医诊断学》、《中华人民共和国药典（2020版）》等对录入的临床症状、合并病、理化指标、处方药物进行统一规范处理。1.3对药物的频次、四气、五味、归经、临床症状以及合并病进行描述性分析。运用关联规则、复杂网络分析方法,挖掘导师治疗DKD的核心药物。此外,对药物-药物、药物-症状进行关联规则分析和聚类分析。2 实验研究部分2.1基于UHPLC/Q-TOF-MS技术分析肾浊方药物主要成分。2.2基于肾浊方物质基础研究鉴定出的化合物,运用网络药理学方法筛选肾浊方治疗DKD可能的作用靶点,预测信号通路、可能作用机制。2.3以自发性糖尿病肾病C57BLKS/J db/db小鼠和同系非糖尿病肾病对照db/m小鼠为实验对象。确定成模后的db/db小鼠随机分为模型组（db/db）、肾浊方组（db/db+SZF）和阳性药物对照组（db/db+Irb）,db/m为空白对照组。实验过程中,每四周检测一次尿白蛋白/肌酐（urinary albumin-to-creatinine ratio,UACR）和空腹血糖,每周称量体重1次。给药16周后,检测各组小鼠血清中肾功能、肝功能、肾损伤因子相关指标,统一检测不同时间段收集的各组小鼠尿液UACR以及肾损伤因子NGAL。HE、Masson和PAS染色法评估肾脏病理变化程度,透射电镜评估肾小球足细胞损伤程度。根据网络药理学预测的结果,围绕足细胞凋亡,运用TUNEL染色、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）、Western Blot（WB）、Real time-PCR（RT-PCR）方法分别检测肾脏细胞凋亡、足细胞损伤、凋亡的相关Maker蛋白表达水平,及相应蛋白在mRNA层面的表达水平。以上综合评估肾浊方治疗DKD的疗效及作用机制。2.4以转基因血管绿色荧光Fli-1品系和野生型AB品系斑马鱼为实验对象,建立斑马鱼血管内皮损伤性血栓模型,分别水溶给予低、中、高不同浓度的肾浊方,同时设置正常对照组、模型对照组和阳性对照组,每组30尾。实验完成后:（1）采用荧光显微镜和NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件,采集并分析每组随机选取的10尾斑马鱼节间血管直径图片和数据,分析斑马鱼节间血管直径,以评价肾浊方对节间血管改善功效。（2）每组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照,统计每组的血栓发生率,以评估肾浊方预防血栓发生功效。（3）运用心跳血液分析系统录制每组随机选取的10尾斑马鱼心跳视频,并运用ZebraBlood 3.4血流分析软件分析不同组别斑马鱼的血流速度,以及各组的心输出量,以评估肾浊方对血流动力学的影响。结果1 临床研究结果1.1基本情况共纳入了符合要求的DKD患者975例,其中微量白蛋白尿期542例（56%）,大量白蛋白尿期168例（17%）,肾衰竭期265例（27%）。微量白蛋白尿期～肾衰竭期患者,男性分别为320、106和178例;女性分别为222、62和87例。微量白蛋白尿期～肾衰竭期患者的平均年龄分别为（53.78±13.08）岁、（55.95±14.39）岁、（58.06±12.59）岁;平均身体质量指数（body mass index,BMI）分别为（24.99±3.64）kg/m2、（25.23±3.44）kg/m2、（24.96±3.14）kg/m2;平均病程分别为（8.75±5.48）年、（11.16±7.33）年、（6.98±3.01）年。1.2四诊信息频数分析1.2.1临床症状分析微量白蛋白尿期～肾衰竭期涉及的临床症状分别有146、190和182个,频次≥15的前10位症状均为小便有泡沫、乏力、视物模糊、眠差、肢体麻木、下肢水肿、大便干结。此外,微量白蛋白尿期为易汗出、头晕和怕冷,大量白蛋白尿期为口干、肢体刺痛和腰痛,肾衰竭期为怕冷、腹胀和口干。1.2.2舌、脉象分析微量白蛋白尿期～肾衰竭期涉及的舌象分别为8、9和10种,均含有的舌象为暗红舌、舌底滞、齿痕舌、胖大舌、细颤舌、淡红舌、嫩舌、裂纹舌,此外,大量白蛋白尿期为舌底瘀,肾衰竭为舌底瘀和紫暗舌;涉及的舌苔分别有10、9和9种,均含有的舌苔为腻苔、腐苔、厚苔、黄白相兼苔、少苔、薄苔,此外,微量白蛋白尿期为白苔、剥脱苔、水滑苔和燥苔,大量白蛋白尿期为黄苔、积粉苔和剥脱苔,肾衰竭期黄苔、积粉苔和燥苔;涉及的脉象分别有12、9和13种,均含有的脉象为弦脉、硬脉、沉脉、涩脉、缓脉、实脉、弱脉、数脉和滑脉,此外,微量白蛋白尿期为细脉、迟脉和虚脉,肾衰竭期为代脉、结脉、缓脉和虚脉。1.2.3合并病分析微量白蛋白尿期～肾衰竭期涉及的合并病分别有208、96和123种,频次≥15的前10位均为高血压病、高脂血症、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变、肥胖、糖尿病泌汗异常、代谢综合征、糖尿病皮肤瘙痒,此外微量白蛋白尿期为脂肪肝和高尿酸血症,大量白蛋白尿期为脂肪肝和糖尿病勃起功能障碍,肾衰竭期为肾性贫血和高尿酸血症。1.2.4药物分析微量白蛋白尿期～肾衰竭期涉及的药物分别有234、163和163味,频次≥15的前10位均为水蛭、大黄、黄芪、丹参,微量白蛋白尿期和大量白蛋白尿期均含有黄连、生姜、知母、鸡血藤、红曲。此外,微量白蛋白尿期为三七,大量白蛋白尿期为茯苓,肾衰竭期为益母草、茯苓、制附子、金樱子、菟丝子和淫羊藿。1.3高频药物剂量分析DKD不同分期,频次≥15的前10位高频药物剂量分析结果显示,微量白蛋白尿期～肾衰竭期,水蛭常用剂量分别为3或6g、3或6g、6 g;大黄常用剂量分别为3或6g、6或9g、9或15 g;黄芪常用剂量分别为15或30 g、30或45 g、60或90 g;丹参常用剂量分别为15 g、15或30 g、30 g。1.4药物四气、五味、归经分析微量白蛋白尿期～肾衰竭期处方药物均以寒、温、平之性为主,以苦、甘、辛味药为多,中药归经以肝经、脾经、胃经为主,其次为肺经、肾经、心经和大肠经等。1.5核心药物分析网络分析显示,微量白蛋白尿期～肾衰竭期不同病情阶段连线较多的药物均是水蛭、大黄、黄芪和丹参,说明以上中药在DKD的治疗中起重要作用,为治疗DKD的核心药物。1.6关联规则分析“药物-药物”关联规则按支持度≥10%,置信度≥90%,微量白蛋白尿期各阶关联规则第一位分别为大黄-水蛭,黄芪+丹参-水蛭,黄芪+丹参+大黄-水蛭;大量白蛋白尿期各阶关联规则第一位分别为水蛭-黄芪、大黄+黄芪-水蛭、丹参+大黄+黄芪-水蛭;肾衰竭期各阶关联规则第一位分别为丹参-水蛭、丹参+大黄-水蛭、丹参+大黄+水蛭-黄芪。“药物-症状”关联规则按支持度≥10%,置信度≥80%,微量白蛋白尿期各阶关联规则第一位分别为水蛭-小便有泡沫、水蛭+黄芪-小便有泡沫、水蛭+丹参+黄芪-小便有泡沫;大量白蛋白尿期各阶关联规则第一位分别为水蛭-小便有泡沫,水蛭+大黄-小便有泡沫,水蛭+丹参+大黄-小便有泡沫;肾衰竭期各阶关联规则第一位分别为水蛭-下肢水肿、水蛭+大黄-下肢水肿、黄芪+大黄+水蛭-下肢水肿。1.7聚类分析不同分期的DKD患者,症状主要聚为以下几类:大便干结、腹胀、眠差、乏力、纳差等聚为一类;腰痛、腰酸、小便淋漓不尽、小便频数聚为一类;视物模糊、肢体麻木、肢体刺痛聚为一类;小便有泡沫、下肢水肿聚为一类;怕冷、耳鸣、夜尿频聚为一类;眠差、多梦、盗汗聚为一类。以上几类症状,提示DKD患者所处的病理状态主要为虚（气虚、阴虚、阳虚）态,瘀（络脉瘀阻）态、浊（水湿浊毒）态、寒（肾阳亏虚）态。药物主要聚为以下几类:清半夏、黄连、瓜蒌等聚为一类;葛根、黄芩、黄连、干姜等聚为一类;水蛭、大黄聚为一类;茯苓、泽泻聚为一类;大黄、制附子聚为一类;桂枝、鸡血藤、甘草聚为一类;知母、黄柏聚为一类。涉及的方剂主要为小陷胸汤、葛根芩连汤、干姜黄芩黄连人参汤、抵挡汤、茯苓泽泻汤、大黄附子汤、黄芪桂枝五物汤、知柏地黄汤等。2 实验研究结果第一部分:基于UHPLC/Q-TOF-MS技术分析肾浊方药物主要成分1.12批肾浊方样品指纹图谱与生成的对照图谱比对,各样品的相似度在0.886～0.995之间,提示不同批次肾浊方样品质量稳定可控。2.肾浊方共鉴定出152个化合物,其中29个成分通过对照品对照鉴定。所鉴定的152个化合物均可在单味药中得到归属,这些成分主要来自于黄芪、大黄、丹参等。第二部分:基于网络药理学探讨肾浊方治疗DKD的潜在作用机制1.根据肾浊方药物成分研究鉴定出来的化合物,筛选了 354的药物靶点,其中94个为治疗DKD的潜在作用靶点。2.药物-疾病靶点的GO和KEGG分析显示,肾浊方治疗DKD主要是通过VEGF signaling pathway、Apoptosis signaling pathway、MAPK signaling pathway、AGEs-RAGE signaling pathway等,涉及的机制主要为细胞凋亡、血管生成、晚期糖基化终末产物、免疫炎症反应、细胞粘附的调节等。第三部分:基于db/db小鼠模型探讨肾浊方治疗DKD的作用机制1.体重:在0～16周,db/m组呈逐渐上升趋势,db/db组、db/db+SZF组和db/db+Irb组变化趋势一致,0～8周逐渐上升,8～16周逐渐下降。与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组对体重无明显影响（p＞0.05）。2.空腹血糖:在0～16周,db/m组呈平稳趋势。db/db组、db/db+SZF组和db/db+Irb组变化趋势一致,在0～4周时,各组显著上升,随后在4～12周呈平稳趋势,12～16周呈下降趋势。与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组对空腹血糖无明显影响（p＞0.05）。3.UACR:在0～16周时,与db/m组相比,db/db组显著上升（p＜0.05）。在12～16周时,与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组明显下降（p＜0.05）。4.尿液NGAL:随着小鼠周龄的增加,各组小鼠尿液中的NGAL均呈上升趋势。0～16周时,相比db/m组,db/db组的NGAL均显著升高（p＜0.01）。在4～16周时,相比db/db组,db/db+SZF组和db/db+Irb组的NGAL均显著下降（p＜0.01）。5.肾重/体重比值:与db/m组相比,db/db组显著升高（p＜0.001）。与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组明显下降（p＜0.001）。6.血清Cre-s、UA、UREA、NGAL:与db/m组相比,db/db组均显著升高（p＜0.01）。与 db/db 组相比,db/db+SZF 组和 db/db+Irb 组均明显下降（p＜0.05）。各组AST、ALT无明显差异（p＞0.05）。7.肾脏病理:与db/m组相比,db/db组肾小球基底膜增厚、系膜细胞增殖、系膜基质累积,以及胶原纤维沉积明显增加。与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组显著缓解以上肾脏病理变化。8.足突宽度、基底膜厚度:与db/m组相比,db/db组均显著增加（p＜0.05）,与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组均显著降低（p＜0.05）。此外,与db/m组相比,db/db组足细胞重度水肿,细胞膜局部模糊,胞内基质稀疏,大面积低电子密度水肿区,细胞器肿胀、崩解,足突大面积融合,与db/db组相比,db/db+SZF组和db/db+Irb组显著缓解以上足细胞病理变化。9.TUNEL染色:与db/m组相比,db/db组肾脏细胞凋亡明显增加,肾浊方和厄贝沙坦干预后能够显著降低肾脏细胞凋亡。10.WB 结果:与 db/m 组相比,db/db 组肾脏 WT-1、Nephrin、Podocin 和BCL-2 表达量显著降低（p＜0.05）,Desmin、cleaved caspase 3 和 cleaved PARP1表达量显著升高（p＜0.05）;肾浊方和厄贝沙坦干预后,WT-1、Nephrin、Podocin和 BCL-2 表达量显著升高（p＜0.05）,Desmin、cleaved caspase 3 和 cleaved PARP1表达量显著下降（p＜0.05）。以上指标IHC和RT-PCR结果与WB的结果变化趋势一致。第四部分:基于斑马鱼模型探讨肾浊方改善微循环的作用机制1.节间血管直径,与正常对照组相比,模型组显著缩小（p＜0.001）,与模型组相比,肾浊方中、高剂量组显著增大（p＜0.05）。2.血栓发生率,与正常对照组相比,模型组显著升高（p＜0.001）,与模型组相比,肾浊方低、中、高剂量组显著降低（p＜0.001）。3.血流速度和心输出量,与正常对照组相比,模型组均显著下降（p＜0.001）,与模型组相比,肾浊方低、中、高剂量组显著增加血流速度（p＜0.01）,肾浊方中、高剂量组显著增加心输出量（p＜0.01）。结论1临床研究（1）基于医案数据挖掘分析得到导师治疗DKD核心药物主要为水蛭、大黄、黄芪和丹参等。在一定程度上反映了导师对DKD病因病机的认识:气虚络瘀是DKD的重要核心病机,虚、瘀、浊为其病理特点,益气活血通络贯穿治疗的始终。（2）在益气活血通络法治疗的基础上,微量白蛋白尿期常兼顾清痰湿,常用方药是葛根芩连汤、干姜黄芩黄连人参汤、大黄黄连泻心汤、小陷胸汤等,旨在改善机体所处的病理内环境,延缓DKD的进展;大量白蛋白尿期常兼顾温阳利水,常用方药是益母草、淫羊藿、茯苓等,旨在促进体内潴留的水液代谢;肾衰竭期常兼顾温阳利水、通腑泄浊、益肾涩精,常用方药是大黄附子汤、水陆二仙丹、淫羊藿、益母草、茯苓、菟丝子等,旨在保护肾功能、提高患者的生活质量。反映了导师遣方用药灵活,擅用经方调态打靶,药少而精,药专力宏。（3）药物的“四气”以寒、温、平为主,寒温并用,体现扶正祛邪、攻补兼施的治法。“五味”以苦、辛、甘为主,取辛开苦降之意,以甘味药调之,防辛开苦降药物损伤人体正气,从而达祛邪不伤正的目的。（4）DKD不同的病情阶段,同一药物,用量不同,尤其是水蛭、黄芪、大黄和丹参四味核心药物,随着病情进展,药物剂量均呈逐渐上升趋势。2 实验研究（1）肾浊方含有多种化学成分,多个靶点,网络药理学预测其治疗DKD涉及的机制主要为细胞凋亡、血管生成、细胞黏附调节、免疫炎症反应等,体现了肾浊方是通过“多成分-多靶点-多途径”协同干预DKD的特点。（2）肾浊方可明显降低UACR、肾功能相关指标以及肾损伤因子水平,改善肾小球基底膜厚度、系膜细胞增殖、系膜基质累积以及胶原纤维沉积等,能够明显缓解足突融合,保护足细胞。此外,肾浊方可通过改善血流动力学、降低血栓发生率,进而改善微循环和微血管功能障碍。（3）肾浊方可能通过上调WT-1、Nephrin、Podocin和BCL-2,下调Desmin、cleaved caspase 3和cleaved PARP1抑制肾小球足细胞凋亡,维持足细胞之间的连接,稳定肾小球基底膜,减缓足细胞损伤,保护肾小球滤过屏障功能,从而达到减少尿白蛋白、保护肾功能,延缓DKD进展的治疗效果。