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目的：近年来国内外的有研究表明,穿通支原体(Mycoplasma penetran,Mpe)感染可能与肿瘤发生相关.本研究通过对胃癌患者的血液和肿瘤组织穿通支原体分离鉴定,分析Mpe感染和胃癌发生、发展相关性,为胃癌发生、发展的生物学因素研究提供一种新的生物学依据,为胃癌的早期诊断和防治提供一种新的途径.并在实验过程中筛选更适合Mpe体外生长的培养基,初步建立Mpe分离鉴定程序,为Mpe感染的实验室诊断、预防、治疗提供理论和实验依据.
方法：1.分离培养我们以2004年4月至2006年4月间就诊于温州医学院附属-医胃肠外科确诊为胃癌患者、对照组胃溃疡患者和体检人群作为本次研究对象,共138例,其中胃癌患者74例,胃溃疡患者20例,体检人群44例.取胃癌组织和胃溃疡组织剪碎后经0.22 μm孔径滤菌器过滤除菌后接种于改良的未加去甲肾上腺素(NOradrenaline,Ne)SP-4培养基、改良的加JNe的SP-4培养基、自制的未加Ne培养基、自制的加Ne液体培养基进行对比培养;患者和体检人群的血液标本离心后取血清分别接种于以上4种培养基中.每次培养均做对照管,以颜色变化时间为初代培养阳性时间.同时利用商品化试剂对每份标本进行人型支原体和解脲支原体的检测.
2.菌株鉴定经处理的血液标本、胃癌和胃溃疡组织标本用4种培养基对比培养,将产酸、变黄的可疑阳性培养物过滤、转种于Mpe固体培养基,经培养3-4天后置光学显微镜下观察菌落,见"油煎蛋"样菌落,证实支原体牛长,注意与L型细菌相鉴别.进一步应用牛化反应试验、套式PCR和核酸序列测定等方法进行鉴定.并在电镜下观察胃癌组织和血液组织中的Mpe形态.
3.电镜观察Mpe阳性的血液和肿瘤组织在电镜下观察穿通支原体形态.
4.临床资料分析对胃癌手术患者切除组织进行病理分析.结合临床资料,对胃癌患者和对照组Mpe检出阳性率进行比较,并在胃癌患者中以肿瘤组织分化高低、淋巴结转移程度以及胃癌患者临床分期各分组比较Mpe感染率.
结果：
1.分离培养结果(1)从74份胃癌患者的血液标本分离到9株Mpe,阳性率12.16﹪(9/74);74份肿瘤组织标本中共计分离培养到21株Mpe,阳性率27.02﹪(20/74);20例胃溃疡患者的溃疡组织中分离培养到1株Mpe,阳性率5.00﹪(1/20);体检人群血液中未分离到Mpe.胃癌患者与对照组的Mpe阳性率比较有显著性差异(P<0.05).
(2)核酸序列分析从胃癌患者血液和肿瘤组织分离到Mpe的16SrRNA序列与2002年Sasaki(HF-2株)报道相一致.
(3)分离培养的30株Mpe在改良未加NF的SP-4培养基为1号培养基、改良加NE的SP-4培养基为2号培养基、自制未加NE的培养基为3号培养基、自制加NE的培养基为4号培养基的甲均初代培养刚性时间分别6.87±1.47、5.07±1.32、7.20±1.48、5.63±1.15天.四种培养基的平均初代培养阳性时间比较:①1号培养基与2号培养基比较有显著性差异(P<0.05);②3号培养基与4号培养基比较有显著性差异(P<0.05);③2号培养基与4号培养基比较无显著性差异(P>0.05).
2.电镜下观察到胃癌患者血液和肿瘤组织典型的Mpe形态.
3.临床分析
(1)74例胃癌患者病理报告中低分化、低分化癌组织胃癌患者Mpe阳性率44.23﹪(23/52),高中分化、高分化癌组织患者Mpe检出阳性率13.63﹪(3/22),两者分离率比较有显著性差异(X<2>=6.349,P<0.05).
(2)74例胃癌患者中早期胃癌(Ⅰ-Ⅱ期)患者Mpe的阳性率16.67﹪(5/30),中晚期胃癌(Ⅲ- Ⅳ期)患者Mpe的阳性率47.72﹪(21/44),两者分离率比较有显著性差异(X<2>=7.55 1,P<0.05).
(3)74例胃癌患者病理报告淋巴结转移(NO-N1)的患者中Mpe的阳性率20.59﹪(7/34),淋巴结转移(N2-N3)的患者中Mpe阳性率47.50﹪(19/40),两者分离率比较有显著性差异(X<2>=5.84,P<0.05).
结论：1.在4种培养基中,加去甲肾上腺素的培养荩穿通支原体生长情况较好.2.分离培养法结合nPCR检测是穿通支原体检测的实用性方法,并获得供研究菌株.3.胃癌的发生、发展和预后可能与穿通支原体感染相关.