活性氧族（reactive oxygen species,ROS）,是细胞内多种正常代谢过程的产物,在生物体内扮演双重角色。适当的ROS浓度有利于细胞的免疫应答反应,例如,适当的ROS浓度在机体抗感染及相关的细胞信号转导过程中发挥重要作用；而ROS浓度过高时却能够对生物体造成伤害,即氧化应激反应（oxidative stress response）。氧化应激反应是指ROS产生过多或代谢障碍并超过内源性抗氧化系统对其的消除能力时,氧化系统和抗氧化系统失衡,过剩的ROS参与氧化生物大分子的过程,最终导致细胞脂质过氧化并致使溶酶体、线粒体损伤,从而导致细胞和组织损伤的一种适应性反应。由于机体会经常暴露在各种来源的氧自由基下,为了保持细胞内氧化还原稳态,机体存在很多抗氧化机制,如预防机制、修复机制、物理防卫及抗氧化防卫等。而在机体抗氧化防卫过程中,有研究证实,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号转导通路在细胞氧化应激反应中起关键作用。已知的 MAPK 家族包括 ERKs（extracellular-regulated kinases）、JNKs（c-jun-NH2-terminal kinases）,p38 MAPK 和 BMK-1（big MAPK-1）。p38 调节活化蛋白激酶（p38 regulated/activated protein kinase,PRAK）最初是作为p38 MAPK的下游激酶被鉴定出来的,属于丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶（MAPK-activated protein kinase,MAPKAPK/MK）家族成员。PRAK 分子量约54 kDa,存在于大多数脊椎动物细胞中,尤以心肌及骨骼肌中表达水平最高。在静息状态下,外源性PRAK主要分布在细胞核内,在细胞应激反应时,PRAK 可以发生核-质移位（nuclear-cytoplasmic translocation）;然而内源性 PRAK的细胞定位则存在争议,不同的研究结果也不一致。在参与细胞的应激反应过程中,PRAK主要受p38 MAPK信号通路调控。早期的研究显示,细胞在应激和致炎因子的刺激下,PRAK的第182位苏氨酸（Thr182）能被p38 MAPK磷酸化而激活,并继而磷酸化并激活热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）,从而介导细胞骨架重构,参与细胞的应激反应;同时p38 MAPK引起的PRAK磷酸化可导致PRAK的核-质移位,但PRAK的移位与其介导的功能有何关系至今未见报道。上述关于PRAK参与p38 MAPK介导细胞应激反应的观点近年来颇受质疑;有研究表明,虽然过表达的p38 MAPK确实能磷酸化PRAK,但生理水平的内源性p38 MAPK并不能显著增加PRAK活性,而且内源性PRAK也不能有效地激活HSP27;蛋白质相互作用分析也未发现内源性的PRAK-p38 MAPK蛋白质复合体的形成。因此,PRAK与p38 MAPK通路的关系,以及PRAK的底物可能都需要重新评价。综上所述,PRAK可能参与多种细胞功能的调控过程,但目前对PRAK的功能及其作用机制认识还很局限,并且在一些问题上仍存在争议;PRAK的激活机制、下游底物、介导的生物学功能等,至今仍未完全清楚,这些问题的回答均需要进一步的研究探讨。传统蛋白质功能研究大多是在已有的工作基础上对某几个蛋白质进行分析,从理论上推导出对疾病发生发展可能具有重要意义的蛋白质,继而进行深入细致的功能研究。而这种“假设驱动”的研究策略往往存在片面性、主观性和低效率等缺点。随着人类基因组计划（human genomic project,HGP）的提前完成,蛋白质组学的理论系统和技术方法已经成为后基因组时代的主旋律。由于蛋白质组学研究具有大规模、高通量、高灵敏度的特点,因此可以有效地、客观地分析细胞内的蛋白质整体。差异蛋白质组学能通过比较样本间蛋白质表达水平的变化,寻找差异分子,用以解决各种生物学问题。目前己涌现出许多新的差异蛋白质组分析方法,其中荧光差异凝胶电泳（differential in gel electrophoresis,DIGE）技术由于继承了二维凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,使得DIGE日益受到关注,成为最受欢迎的定量蛋白质组学研究手段之一。DIGE是一种在2-DE电泳之前进行荧光染料标记蛋白样品的方法,通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记,在同一块双向电泳凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品,并且每块胶上均引入了内标,内标的利用可以进一步增加可信度,确保结果能反映出真实的生物学差异,避免了系统误差对实验结果的影响,从而能够对样品间蛋白质丰度差异进行精确分析。基于以往的研究基础,本课题主要关注的是在细胞氧化应激反应早期与PRAK相关的差异蛋白质,故本实验选用PRAK+/+和PRAK-/-型的小鼠成纤维细胞作为研究对象,利用亚砷酸钠作为氧化应激分子,利用基于DIGE-基质辅助激光解吸离子化-飞行时间/飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF）-生物信息学（bioinformatics）的差异蛋白质组学技术平台,来寻找并分析在细胞氧化应激反应早期与PRAK相关的差异蛋白质。从而为进一步加深对PRAK的功能认识提供实验数据,为寻找PRAK参与细胞氧化应激反应调控过程的相关功能蛋白提供了机遇。根据DIGE的差异图谱并结合Decyder分析软件进行差异蛋白点分析,差异倍数上调1.5倍或下调1.5倍以上的列为差异蛋白点。PRAK+/+刺激组和PRAK+/+对照组相比较,共找到了6个差异蛋白点,其中上调的有1个,下调的有5个。PRAK-/-刺激组和PRAK-/-对照组相比较,共找到了 46个差异蛋白点,其中上调的有17个,下调的有29个。PRAK-/-对照组和PRAK+/+对照组相比较,共找到了 26个差异蛋白点,其中上调的有21个,下调的有5个。有些差异蛋白点在几组之间均有变化,共分析出60个差异蛋白质点。利用全自动切胶仪Spot picker挖取这些差异蛋白胶粒,然后进行样品胶内酶解,使用AB 4800 MALDI TOF/TOF质谱仪进行分析。通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白,去除鉴定结果相同的蛋白及8个未鉴定出来的蛋白点,共鉴定出38种蛋白质。对鉴定出的所有38种差异蛋白进行生物信息学的功能分析。首先对鉴定的差异蛋白进行亚细胞定位分析,利用亚细胞定位软件WOLF PSORT进行检索。结果表明,32个蛋白存在胞浆定位,26个蛋白存在细胞核定位,25个蛋白存在胞浆和细胞核穿梭,13个蛋白存在线粒体定位,7个蛋白有细胞外定位,2个蛋白有胞浆和线粒体穿梭,1个蛋白有胞浆和胞膜穿梭,1个骨架蛋白定位,1个有内质网定位。这些结果可以推测,多数差异蛋白存在胞浆和细胞核穿梭,这可能与氧化应激反应早期细胞内氧化系统和抗氧化系统的功能事件的调控有关。接着对蛋白质进行功能分析,利用蛋白质数据库的蛋白质结构域（domain）和模体（motif）的分析,粗略地对鉴定的蛋白质进行功能分组,把这些差异蛋白功能主要归纳为以下6类:核苷酸结合蛋白类;细胞骨架蛋白类;分子伴侣蛋白类;膜运输蛋白类;功能调节蛋白类;代谢酶蛋白类。蛋白质行使功能通常是通过蛋白质之间相互作用来实现的。为了解差异蛋白质之间相互作用关系,利用String蛋白相互作用数据库对蛋白质间的相互作用进行预测和分析。结果发现这些蛋白质中,有21种蛋白质在蛋白质相互作用网络上同时出现。推测这些差异蛋白质之间是有功能联系的,可能与细胞的抗氧化功能有关。这些差异蛋白质经过生物信息学分析,并通过调研文献发现,我们选取“过氧化物还原酶4”（peroxiredoxin-4,Prdx4）作为感兴趣的蛋白进行验证。Prdx4主要功能是参与氧化还原调节过程,在细胞质中可以通过调控NF-κB抑制蛋白α（inhibitor-κ-binding α,I-κBα）的磷酸化来激活NF-κB的活性,而且Prdx4基因还表现出硫氧还蛋白（thioredoxin,TRX）依赖的过氧化物酶活性和细胞的增殖分化等功能。Prdx4的表达差异与PRAK的关系如何?Prdx4基因表达是否受PRAK蛋白的调控?Prdx4是否为PRAK下游底物分子?Prdx4在细胞氧化应激反应中到底发挥着什么样的生物学功能?这些都值得去探讨。通过对Prdx4在PRAK+/+和PRAK-/-细胞的表达量进行Western blot验证,发现了两排比较清晰的条带,结合蛋白条带的分子量,经查阅文献后,推测这两个蛋白条带均为Prdx4的氧化或者过氧化二聚体,上面分子量大的约60 kDa左右,推测是氧化的Prdx4的同源二聚体,另外一个分子量约50 kDa左右,推测是氧化的Prdx4-Prdx1异源二聚体。Prdx4的同源二聚体和异源二聚体在PRAK+/+control组细胞中的水平很低,但是在PRAK+/+treat组细胞中,Prdx4的同源二聚体水平增高；然而在PRAK-/-control组和PRA-/-treat组,Prdx4的同源二聚体和异源二聚体在细胞中的水平较高,氧化应激前后变化不明显。根据实验结果进行推测,PRAK+/+control组细胞内的ROS水平处于比较低的水平,当发生急性氧化应激的时候,Prdx4蛋白迅速表达上调,生成Prdx4的同源二聚体;PRAK-/-细胞组,由于PRAK基因的敲除,细胞内出现了 Prdx4的代偿性升高,Prdx4的二聚体水平也增高,使细胞处于比较低的ROS水平,在氧化应激早期时,对ROS水平的影响很小,因此,Prdx4的二聚体水平无明显变化。通过 Real time PCR 实验,发现 Prdx4 的 mRNA 水平在 PRAK+/+control 组表达较低,在PRAK+/+treat组迅速上调,约为PRAK+/+control组1.4倍;而在PRAK-/-control组和PRAK-/-treat组表达比较高,并且两组间无明显差异,约为PRAK+/+control组2倍。根据实验结果推测:PRAK+/+ control组由于细胞处于相对氧化还原平衡的状态,Prdx4的表达处于低水平,一旦发生氧化应激,Prdx4基因会快速启动转录;而PRAI-/-control组和PRAK-/-treat组均表达比较高,说明PRAK基因的敲除后,Prdx4起到抗氧化的代偿作用,用来平衡细胞内的ROS水平。为了检测Prdx4是否能够通过调控IκBα的磷酸化从而激活NF-κB,Western blot实验结果表明,IκBα的磷酸化水平与Prdx4的同源二聚体的表达趋势一致。根据实验结果推测,在PRAK+/+细胞组,由于PRAK可以通过p38-MAPK信号通路激活NF-κB,所以PRAK+/+control组IκBα的磷酸化水平较低,而在氧化应激时IκBα的磷酸化水平也会上调发挥抗氧化作用;而由于PRAK--细胞组PRAK蛋白的缺失,Prdx4的同源二聚体可能参与了 NF-κB的激活,启动细胞抗氧化蛋白的转录表达。所以,Prdx4的同源二聚体可能参与了 IxBα的磷酸化调控,在氧化应激反应中发挥重要作用。通过细胞免疫荧光实验,可以更加形象的观察Prdx4在细胞内的定位及移位情况。实验结果表明,在PRAK+/+细胞系中,随着亚砷酸钠刺激时间（0h、1h、2 h、4 h）的延长,Prdx4主要分布在细胞浆中,其表达量有逐渐增高的趋势,Prdx4的核定位现象也有逐渐增加趋势,另外,观察到PRAK+/+细胞的细胞核形状逐渐皱缩；而在PRAK-/-细胞系中,Prdx4的表达量在Oh、1h和2h变化趋势不明显,在4 h达到高峰,核定位现象及细胞核形状也是同样的趋势。可以推测,在PRAK+/+control组细胞,Prdx4自身的表达量比较低,在急性氧化应激下,突然升高的ROS水平可以迅速启动细胞信号转导,导致Prdx4的表达量逐渐升高;并且入核现象逐渐增多,可能是Prdx4的多聚体发挥了伴侣分子作用,携带某些核转录因子入核;随着刺激时间的延长,细胞启动了凋亡程序,细胞核逐渐皱缩。而在PRAK-/-细胞,由于PRAK蛋白的缺失,Prdx4表达量处于高水平,而ROS处于低水平,在急性氧化应激下,ROS调控的细胞信号转导没有迅速激活,导致了 Prdx4表达量在1～3 h 比较稳定,无明显升高趋势,直到4 h才观察到急剧升高;核定位现象也说明了细胞启动核转录调控的时间比较晚;而这种低氧化水平对PRAK-/-细胞起到一定的保护作用,同时也对细胞对外界环境的反应出现了迟钝现象。为了观察PRAK+/+和PRAK-/-细胞系对NaAsO2刺激不同时间点的细胞内ROS水平的变化,本课题进行了细胞内ROS水平检测,通过实验数据观察到如下现象,PRAK+/+细胞内ROS的水平约为PRAK-/-细胞的2倍左右,随着刺激时间的延长,PRAK+/+细胞的ROS水平迅速升高为正常水平的1.5倍左右,然后稳定在这个水平。而PRAK-/-细胞ROS水平比较低,在1～4 h都比较稳定,但是5 h和6 h时迅速升高,最后达到PRAK-/-细胞正常ROS水平的2倍左右。可以推测,在PRAK+/+细胞内,Prdx4表达量比较低,当受到氧化应激时,ROS的迅速升高可以启动细胞的抗氧化系统,导致ROS处在稳定的水平;而对PRAK-/-细胞系而言,由于高表达量的Prdx4的代偿,使ROS处于低水平,当细胞处于氧化应激状态下,高表达量的Prdx4可以发挥抗氧化功能,ROS升高比较缓慢,直到Prdx4无法代偿时才出现ROS的急剧升高。为了观察PRAK+/+和PRAK-/-细胞系对NaAsO2刺激不同时间点的细胞生存率的变化,本课题进行了 MTT实验,通过实验数据观察到如下现象,在氧化应激反应中,PRAK+/+细胞生存率明显高于PRAK-/-细胞系。可以推测,PRAK基因的敲除,会对细胞的抗氧化应激功能产生一定的影响,Prdx4的代偿性高表达在发挥细胞保护功能的同时,也对细胞抗氧化相关的信号转导通路的激活起到抑制效果,致使PRAK-/-细胞对氧化应激不耐受。为寻找与PRAK相关的蛋白质复合物,我们建立了蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（blue native PAGE,BN-PAGE）,力图找到与PRAK蛋白相关的差异蛋白质复合物,然后切取差异复合体,联合SDS-PAGE及质谱分析技术鉴定差异蛋白复合物的组分。找到了 1条PRAK蛋白相关的差异蛋白质复合物,并对复合体的18个组分进行了质谱鉴定。通过研究得出如下3点结论:1.成功建立了 PRAK+/+细胞和PRAK-/-细胞的DIGE差异图谱,分析后得到60个差异蛋白质点,质谱共鉴定出38种差异蛋白质。这些差异蛋白可能与氧化应激反应早期PRAK调控的生物学功能相关。2.在氧化应激反应中,当敲除PRAK基因后,Prdx4基因发生了转录水平的代偿性高表达,Prdx4本身除了发挥抗氧化功能外,Prdx4同源二聚体有可能通过调节IκBα的磷酸化激活NF-κB,启动抗氧化相关基因的转录调控,从而维持细胞内ROS的平衡。3.建立了联合BN-PAGE/SDS-PAGE/MS的蛋白质复合体分离鉴定技术平台,找到了 1条PRAK相关的差异蛋白质复合物,并对复合物的18种组分进行了质谱鉴定。本研究不仅为重新认识PRAK的激活机制、下游底物、介导的生物学功能等方面提供了实验数据,也为探讨PRAK在氧化应激反应早期发挥功能的分子机制奠定了基础。