钙离子作为细胞内重要的第二信使,参与了包括肌肉收缩、神经递质释放、基因表达、细胞增殖及凋亡等在内的许多重要的生理及病理过程。细胞内钙离子浓度的变化在时间及空间上并不是一个整体同步变化的过程,在不同的刺激及细胞活动中,不同的细胞器或亚细胞结构内钙离子浓度的变化并不同步,并且各自参与了不同的生命活动。例如,在神经系统突触部位,神经冲动导致突触前局部钙浓度升高,这一升高导致神经递质的释放进而完成神经冲动在突触部位的传递;作为细胞的能量工厂,线粒体存在着独立的钙离子转运系统,线粒体内钙离子的浓度变化可影响ATP的产生及线粒体膜的通透性,从而介导细胞的凋亡过程。细胞核作为细胞内最重要的细胞器之一,是许多重要功能活动的参与者和发生场所。细胞核内钙离子的浓度变化可以影响基因表达、核蛋白及RNA的运输、DNA及核蛋白的降解、细胞分裂等重要生命过程。近年的研究表明,细胞核内钙浓度的升高为细胞增殖所必需,同时,核内钙浓度的变化可以介导神经元突触活动引起的基因转录,是将神经元电活动与核内基因表达相耦联的重要信号。因此,揭示细胞核内钙离子信号的产生及调控机制对阐明神经细胞功能及突触活动编码机制具有重要意义。细胞核由核膜所包裹,核膜由核外膜和核内膜组成,内外膜之间为核周隙,与内质网腔相连。核膜上还有许多散在的核孔,在核孔周围,核膜的内层与外层相连。核孔是细胞核与细胞质进行物质交换的孔道。传统观点认为,核孔可以自由通透小分子和离子,钙离子可以从胞浆经核孔自由扩散到核浆中,核内钙离子浓度的变化完全依赖于胞浆内钙浓度的变化。但利用膜片钳及原子力显微镜对核孔结构进行研究时发现,核孔并不是一直处于开放状态的,在很多情况下,核孔会被中央栓所封闭,通透性很低。同时,近年的研究表明,与内质网腔相连的核周隙可以作为一种钙库,成为核内钙离子的重要来源。位于核外膜的钙泵将钙离子泵入核周隙,而位于核内膜的IP3受体及Ryanodine受体可以介导钙离子从核周隙释放入核浆。但对于核周隙钙离子释放的调控机制目前尚不明确。本研究发现,大电导钙激活钾通道(BKCa通道)可以表达于细胞核膜并对核周隙钙离子的释放及细胞核内钙离子浓度变化具有调控作用。1.BKCa通道在原代培养海马神经元细胞核膜的表达在原代培养的海马神经元中,使用BKCa通道特异性抗体进行免疫细胞化学实验,发现BKCa通道除表达于细胞膜外,在细胞核周围亦存在表达。为确定BKCa通道是否可以定位于神经元细胞核膜,我们使用蔗糖密度梯度离心的方法分离了完整的原代培养海马神经元细胞核。使用特异性识别BKCa通道C末端的一抗和荧光二抗进行免疫细胞化学实验证明BKCa通道表达于分离的神经元细胞核。由于在对分离的细胞核进行免疫细胞化学实验时并未使用Triton-X100等去污剂,此时核膜对抗体不通透,抗体无法穿透核膜而进入核周隙,此时检测到BKCa通道的表达提示BKCa通道C末端朝向胞浆侧。为排除抗体的非特异性结合,我们在神经元和U87细胞中过表达与绿色荧光蛋白（GFP）相融合的全长BKCa通道,发现其与核膜标志物LaminB共定位。在使用BKCa通道胞内段与GFP融合的质粒（CG1及C32）转染细胞时发现,不论GFP位于胞内段的C末端（CG1）还是N末端（C32）,绿色荧光均不能定位于细胞核,此结果说明BKCa通道在细胞核膜的定位不依赖于其胞内段。我们使用试剂盒提取原代培养海马神经元不同亚细胞结构的蛋白质,利用免疫印迹实验发现BKCa通道除定位于细胞膜和线粒体外,在细胞核成分也存在丰富的表达,同时,去极化刺激（60mM KCl）并不影响BKCa通道在各组分的表达量。进一步,我们对分离的完整的神经元细胞核进行免疫印记实验,证明BKCa通道蛋白表达于细胞核并定位于核膜。去除掉核膜的裸露的细胞核未检测到BKCa通道的表达。在U87细胞中过表达BKCa通道后提取核蛋白,与过表达对照质粒组比较,BKCa通道在细胞核的表达增多;使用特异性针对BKCa通道的microRNA干扰BKCa通道在U87细胞中内源性的表达后,提取核蛋白进行免疫印迹检测,结果显示,针对BKCa通道的microRNA质粒可以降低BKCa通道在细胞核的表达,这进一步证明BKCa通道在细胞核中的定位。此外,我们使用内面向外模式对分离的培养海马神经元细胞核进行电生理记录,膜片钳记录检测到钾离子电流活动,单通道电导为224.4pS,与BKCa通道电导相符,且该电活动可以被BKCa通道特异性阻断剂paxilline所阻断,这进一步证明了BKCa通道在细胞核膜上的功能性表达。2.细胞核BKCa通道的功能活动影响细胞核膜电位及细胞核钙信号使用电压敏感性染料DiOC6（3）孵育分离的完整细胞核,由于该染料的亲脂性,其主要分布于细胞核膜,该染料荧光强度的变化反映核膜电位（ΔΨn）的变化。BKCa通道特异性阻断剂paxilline可使DiOC6（3）荧光强度增强,提示paxilline使核膜发生超极化,而BKCa通道特异性激动剂NS1619可使DiOC6（3）荧光强度减弱,提示NS1619使核膜发生去极化,paxilline可以部分逆转NS1619的作用。使用钙离子指示剂Fluo4-AM孵育分离的完整的细胞核,由于该染料具有膜通透性,染料主要分布于核周隙中,染料荧光强度的改变反映核周隙中钙浓度的变化;与之相对应,钙离子指示剂Fluo4-Dextran（10,000 MW）孵育分离的完整的细胞核,由于该染料的不能穿透膜结构,染料主要分布于核浆中,染料荧光强度的改变反映核浆中钙浓度的变化。BKCa通道特异性阻断剂paxilline处理细胞核,可以使Fluo4-AM荧光值降低而使Fluo4-Dextran荧光强度升高。此现象说明,paxilline可以使核周隙中的钙离子流入核浆。Paxilline诱导的核周隙钙释放过程可以被钙泵阻断剂Thapsigargin及Ryanodine受体特异性阻断剂Ruthenium Red所阻断,而IP3受体特异性阻断剂Heparin则不能阻断paxilline的作用,提示paxilline对核周隙钙离子的释放主要依赖于Ryanodine受体。BKCa通道的另一种特异性阻断剂IbTx是肽类阻断剂,不能自由穿透膜性结构,其阻断细胞膜BKCa通道的机制为在细胞膜外侧通道口处阻塞通道。在实验中IbTx未能引起细胞核钙离子浓度的改变,综合考虑免疫细胞化学实验的结果,提示BKCa通道在核膜上的方向为其C末端朝向胞浆侧,而可被IbTx调控的通道口位于核周隙中。我们进一步在原代培养的海马神经元中观察了Paxilline对细胞核及细胞浆钙浓度的调节作用。Paxilline作为BKCa通道的阻断剂,在培养海马神经元中可以同时升高细胞浆钙离子浓度([Ca2+]c)及细胞核内钙离子浓度([Ca2+]n)。BKCa通道激动剂NS1619可以阻断paxilline的作用,而BKCa通道的另一种阻断剂IbTx由于只能阻断细胞膜上的BKCa通道,其仅引起[Ca2+]c的少量升高,而对[Ca2+]n无显著影响。使用IbTx预处理后再使用paxilline刺激,[Ca2+]n则明显升高。使用EGTA螯合细胞外液钙离子后,paxilline仍可以诱导[Ca2+]n的升高,而使用钙泵阻断剂Thapsigargin及Ryanodine受体特异性阻断剂Ruthenium Red则阻断了大部分paxilline诱导的[Ca2+]n升高。同时使用EGTA及Thapsigargin则完全阻断了[Ca2+]c及[Ca2+]n的变化。以上结果说明paxilline可以在完整细胞中调控钙库的释放而增加[Ca2+]n。3.细胞核BKCa通道调控神经元电活动诱导的细胞核钙信号神经元电活动可以引起细胞核钙离子浓度的变化,这一变化导致细胞核内钙敏感性转录因子的激活及其下游基因的表达。神经元通过这一信号通路将电活动与基因表达相耦联,将短时程的突触活动编码于长时程的基因表达中,以此完成突触活动对神经元功能的长期调控。细胞核钙浓度的变化是这一编码通路的重要环节,因此,发现细胞核钙信号的调控机制对阐明上述编码机制具有重要意义。我们的研究发现,paxilline可以影响神经元电活动诱导的细胞核钙浓度变化。在paxilline预处理后,去极化刺激（KCl刺激）诱导的核内钙浓度升高幅度不变而速度（斜率）增加,且处在峰值的时间缩短。使用GABA受体阻断剂Bicuculine模拟突触电活动,[Ca2+]c及[Ca2+]n升高并波动性维持在较高水平,但在使用paxilline预处理后,Bicuculine诱导的[Ca2+]n波动迅速回落。以上结果说明paxilline可以影响神经元电活动诱导的细胞核钙信号,在突触电活动的基因编码中起到重要作用。4.细胞核BKCa通道的功能活动影响CREB磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（cAMP Response Element Binding Protein,CREB）是重要的钙敏感性转录因子。钙离子浓度升高时CREB发生磷酸化,磷酸化的CREB（p-CREB）可以与相应的启动子结合,激活下游基因的表达。由于BKCa通道功能活动可以影响细胞核钙离子浓度,我们进一步观察了BKCa通道对核钙浓度的影响是否会影响转录因子CREB的磷酸化水平。使用BKCa通道特异性阻断剂paxilline处理分离的细胞核,提取核蛋白进行免疫印迹实验,分别使用低钙及高钙溶液刺激的细胞核作为对照,结果显示paxilline可以在不增加ERK磷酸化水平的情况下增加CREB磷酸化水平,BKCa通道特异性激动剂NS1619可以阻断paxilline的作用。同时,在免疫细胞化学实验中也得到相似结果。以上结果表明paxilline可以通过促进核周隙的钙离子释放入核浆而增加CREB的磷酸化水平。总结以上结果,我们发现BKCa通道可以表达于细胞核膜,细胞核膜上的BKCa通道可以调节核膜电位,影响核内钙离子浓度,调控突触活动与细胞核钙浓度变化间的耦联,调控转录因子的激活。细胞核BKCa通道的发现及功能研究对阐明细胞内钙信号传递过程、调控机制及其对细胞功能活动的影响具有重要意义,对阐明神经元突触活动的基因编码过程及学习、记忆等突触活动相关生理活动及神经系统疾病的机制具有重要意义。