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一、研究背景骨肉瘤（osteosarcoma,OS）为一种常见的青少年原发性骨肿瘤,发病率约占儿童恶性肿瘤的2.4%。自上世纪70年代起采用手术联合新辅助化疗进行治疗后,患者5年生存率获得显著提高,但近30年来,患者的5年生存率并没有进一步改善。此外,存在转移病灶或复发的骨肉瘤患者即使采用新辅助化疗方案联合手术治疗,其5年存活率仍<20%。从某种程度上来说,近30年来骨肉瘤患者五年存活率没有进一步提高的主要原因是化疗耐药。近期一项多中心、大样本的临床研究显示经典的MAP（methotrexate甲氨蝶呤,cisplatin顺铂,doxorubicin阿霉素）化疗方案仍是治疗骨肉瘤的金标准。此外,虽然顺铂作为一种DNA损伤药物,属于临床治疗骨肉瘤的经典化疗方案用药,但其剂量相关的肾毒性、耳毒性、性功能障碍等并发症,限制了其临床使用剂量。因此,如何提高骨肉瘤患者对化疗药物的敏感性,已成为当前各国学者研究的焦点。虽然引起骨肉瘤化疗耐药的明确机制尚不明,但目前公认的机制包括以下几个方面:1、细胞内化疗药物聚集能力的下降;2、化疗药物的失活;3、DNA损伤修复能力的增强;4、促存活信号通路的异常激活;5、凋亡及细胞周期相关基因表达异常;6、microRNA的异常表达;7、肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）的存在。PI3K（Phosphoinositide 3-kinase）-Akt-mTOR（mammalian target of rapamycin inhibitor）信号通路参与多种细胞生理、病理过程,包括细胞生长、增殖、存活、凋亡、化疗耐药,并常在肿瘤细胞内异常激活。由于PI3K-Akt-mTOR信号通路在化疗耐药方面发挥重要作用且其在肿瘤细胞常异常激活,因此,抑制该信号通路已被认为是提高化疗疗效的一个靶点。然而,近年来不少研究显示,抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路活性可对肿瘤细胞化疗敏感性产生双重作用:促进耐药或提高化疗敏感性。虽然引起骨肉瘤耐药的具体机制尚不明确,但近年来多数研究显示PI3K-Akt-mTOR信号通路是骨肉瘤的一个重要特征并在骨肉瘤的发生、发展及耐药中发挥重要作用,抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路的活性有望成为骨肉瘤辅助治疗的一个方向。自噬,作为一种进化上的保守过程,通过溶酶体降解细胞内组织或器官,在维持细胞内环境稳定方面发挥重要作用,简单来说是指细胞通过单层或双层膜将待降解物进行包裹,形成自噬体（autophagosome）,然后运送到溶酶体（Lysosome）形成自噬溶酶体（autophagolysosome）,随后自噬溶酶体内的水解酶降解待降解物,以满足细胞代谢需要和维持内环境稳定的过程。自噬具有促进细胞死亡及生存两方面作用,营养不足时,通过降解大的细胞质及器官,自噬能为细胞的生存通过能量;然而,在另一些因素诱导下,自噬却可以引起通过Ⅱ型细胞死亡（typeⅡ cell death）或与细胞死亡通路（包括凋亡）相联系,引起细胞死亡。目前普遍认为,在面对不同刺激时,自噬会在细胞内产生四种作用:细胞保护性、细胞毒性、细胞静止性、非细胞保护性。研究显示,细胞的免疫状态、p53状态、凋亡发生能力、HMGB1氧化还原状态可决定自噬的功能。近年来,通过靶向自噬转化自噬功能的方法已被用于提高肿瘤细胞（包括骨肉瘤细胞）对化疗药物的敏感性。2015年年初,美国总统奥巴马在国情咨文中提出了一个预算2.15亿美元的“精准医学计划”（Precision Medicine Initiative）,希望以此“引领一个医学新时代”。精准医学是以个体化医疗为基础,采用基因组学、蛋白质组学等技术,对于大样本特定疾病的类型进行生物学标志物的分析、鉴定,精确寻找到疾病产生的原因和治疗靶点,以期实现对不同疾病、不同患者的个性化精确的治疗目的,提高疾病预防及诊治水平。换句话说,精准医学是根据患者的个人差异性,量体裁衣式地制定个性化的治疗方案。随后,中国国家科技部发布了发布9个2016年国家重点研发专项指南,其中“精准医学研究”位列其中。未来的数十年将是精准医学、靶向治疗研究的黄金时期。虽然引起骨肉瘤发生、发展、化疗耐药的具体机制不明确,但过度激活的PI3K-Akt-mTOR信号通路是骨肉瘤的一个特征,且在骨肉瘤发生、进展、药物抵抗方面发挥重要作用,因此,采用该信号通路的特异性抑制剂,能否提高骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性,值得我们进行研究。NVP-BEZ235是诺华公司（Novartis）研发的一种双PI3K/mTOR抑制剂,能特异性抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路的活性,属于PI3K-Akt-mTOR信号通路的一个靶向抑制剂,已被证实能有效抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导凋亡发生。此外,在一些顺铂耐药的肿瘤细胞内,NVP-BEZ235能通过诱导自噬提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性。然而,NVP-BEZ235能否提高骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性尚不明确。二、目的通过体外在骨肉瘤U20S和Saos-2细胞及体内U20S裸鼠荷瘤模型内进行实验,探讨双PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235能否调节骨肉瘤细胞对顺铂敏感性及相关机制。三、材料与方法体外研究,首先采用CCK-8实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235对骨肉瘤U20S、Saos-2和MG-63细胞的半数抑制浓度,采用联合指数判断NVP-BEZ235与顺铂的在骨肉瘤U20S、Saos-2和MG-63细胞内的协同效应;随后采用Western blot实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞细胞内PI3K-Akt-mTOR信号通路活性的影响;采用Annexin V-PI双染流式细胞仪、Western blot实验、SiRNA敲低自噬关键蛋白Atg-5表达的实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235在骨肉瘤U20S和Saos-2细胞内诱导的自噬的功能。体内研究,首先构建骨肉瘤U20S裸鼠荷瘤模型,待肿瘤荷瘤成功后,通过灌胃或静脉注射方式给予裸鼠用药。用药过程及用药结束后,定期测量肿瘤大小、裸鼠体重。随后将裸鼠猝死,取肿瘤组织进行后续生化实验,检测肿瘤组织内增殖（通过Ki67染色）及凋亡（TUNEL染色）情况。四、结果1.NVP-BEZ235在骨肉瘤U20S、Saos-2和MG-63细胞内协同提高顺铂的抗增殖作用首先,采用CCK-8实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235对骨肉瘤U20S,Saos-2和MG-63增殖的影响。CCK-8实验结果显示骨肉瘤,Saos-2和MG-63细胞对不同浓度的NVP-BEZ235或/和顺铂具有不同反应。随后,采用CalcuSyn software软件分析两药联合指数是否为协同效果,结果显示NVP-BEZ235与顺铂的联合指数<1,提示NVP-BEZ235协同提高顺铂对骨肉瘤U20S,Saos-2和MG-63细胞的抗增殖作用。2.单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235对骨肉瘤U20S和Saos-2细胞内PI3K-Akt-mTOR通路的活性的调节作用不同采用Western blot实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235处理后骨肉瘤U20S和Saos-2内PI3K-Akt-mTOR信号通路的活性。结果显示,顺铂能在骨肉瘤U20S和Saos-2内引起剂量依赖性的PI3K-Akt-mTOR信号通路活性的短暂激活,而单独使用NVP-BEZ235处理或NVP-BEZ235联合顺铂处理则能持续抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路的活性。3.NVP-BEZ235在骨肉瘤细胞内协同提高顺铂诱导凋亡采用流式细胞仪及荧光染色检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235处理组内骨肉瘤U20S和Saos-2细胞凋亡发生率。结果显示单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235均能诱导骨肉瘤U20S和Saos-2细胞发生凋亡,NVP-BEZ235联合顺铂组较单独顺铂或单独使用NVP-BEZ235组凋亡发生率更高。此外,采用Western blot实验用检测凋亡蛋白cleaved PARP和cleaved caspase-3。结果提示NVP-BEZ235能在骨肉瘤U20S和Saos-2细胞内协调提高顺铂诱导凋亡的能力。4.NVP-BEZ235与顺铂的协同作用与p53或TAp73信号通路的激活无关采用Western blot、qPCR实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235处理骨肉瘤U20S和Saos-2细胞后,细胞内p53、TAp73及其靶基因NOXA,p21和PUMA的表达情况。结果显示NVP-BEZ235联合顺铂处理组内p53、TAp73及其靶基因NOXA,p21和PUMA的表达明显低于顺铂处理组。以上结果显示NVP-BEZ235与顺铂的协同作用与p53或TAp73信号通路的激活无关5.NVP-BEZ235通过转化顺铂诱导的自噬的功能提高骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性首先,采用Western blot、GFP-RFP-LC3腺病毒转染实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235处理能否诱导骨肉瘤U20S和Saos-2细胞发生自噬,自噬抑制剂3-MA（3-Methyladenine）,CQ（Chloroquine Phosphate）能否抑制骨肉瘤U20S和Saos-2细胞自噬发生。随后,采用流式细胞仪、SiRNA、Western blot实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235处理在骨肉瘤U20S和Saos-2细胞内诱导的自噬的功能。结果显示顺铂在骨肉瘤U20S和Saos-2细胞内均能诱导细胞保护性自噬发生,抑制顺铂诱导的自噬能进一步提高骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的凋亡发生率;NVP-BEZ235联合顺铂处理却在U20S内诱导细胞毒性自噬,抑制该自噬能降低U20S凋亡发生率;NVP-BEZ235联合顺铂在Saos-2细胞内诱导非细胞保护性自噬发生,抑制该自噬对凋亡发生率无明显影响。以上结果提示NVP-BEZ235通过转化顺铂诱导的自噬的功能提高骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。6.NVP-BEZ235通过下调HMGB1的表达转化顺铂诱导自噬功能采用Western blot实验检测单独使用顺铂、单独使用NVP-BEZ235、顺铂联合NVP-BEZ235处理后骨肉瘤U20S和Saos-2内HMGB1的表达。结果显示,顺铂能在骨肉瘤U20S和Saos-2内引起HMGB1的高表达,而NVP-BEZ235联合顺铂处理则能降低顺铂诱导HMGB1的表达。提示NVP-BEZ235可能通过下调HMGB1的表达转化顺铂诱导自噬功能。7.NVP-BEZ235能在U20S裸鼠模型内提高骨肉瘤细胞对顺铂敏感性为了进一步探讨NVP-BEZ235联合顺铂在体内的效果,我们构建了骨肉瘤U20S细胞的裸鼠模型并分为4组:1、空白对照组;2、顺铂处理组;3、NVP-BEZ235处理组;4、NVP-BEZ235联合顺铂处理组。裸鼠模型构建成功后,进行药物处理。肿瘤增长曲线显示NVP-BEZ235联合顺铂处理组肿瘤体积增长明显少于空白组、顺铂处理组和NVP-BEZ235处理组。在第21天,将裸鼠猝死并测量肿瘤体积。发现NVP-BEZ235联合顺铂处理组肿瘤体积明显小于空白组、顺铂处理组及NVP-BEZ235单药处理组。此外,我们对肿瘤组织进行免疫组化染色分析,发现NVP-BEZ235联合顺铂处理组内肿瘤组织的增殖（Ki-67染色）明显低于空白组、顺铂处理组及NVP-BEZ235单药处理组;而NVP-BEZ235联合顺铂处理组内肿瘤的凋亡（TUNEL染色）发生率明显高于空白组、顺铂处理组及NVP-BEZ235单药处理组。这些结果提示NVP-BEZ235能在骨肉瘤裸鼠体内提高骨肉瘤细胞对顺铂敏感性。五、结论1、NVP-BEZ235能有效抑制骨肉瘤U20S和Saos-2细胞增殖及诱导凋亡发生;2、顺铂能在骨肉瘤细胞内早期激活PI3K-Akt-mTOR通路的活性,而NVP-BEZ235单独或联合顺铂,均能持续抑制PI3K-Akt-mTOR通路的活性;3、NVP-BEZ235可协同提高顺铂对骨肉瘤U20S及Saos-2细胞的抗增殖作用;4、NVP-BEZ235可协同提高顺铂对骨肉瘤U20S及Saos-2细胞的凋亡诱导作用;5、NVP-BEZ235协同提高顺铂对骨肉瘤U20S及Saos-2细胞抗增殖、凋亡诱导与p53或TAp73信号通路无关;6、NVP-BEZ235可通过转化顺铂诱导的自噬的功能提高骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性;7、NVP-BEZ235通过下调顺铂上调的HMGB1的表达转化自噬功能;8、NVP-BEZ235能在U20S裸鼠荷瘤模型内提高骨肉瘤细胞对顺铂敏感性;9、联合使用NVP-BEZ235对提高骨肉瘤细胞对顺铂敏感性有一定临床指导意义。