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第一部分临床研究目的:通过临床研究明确升清降浊胶囊对CKD患者的肠道屏障功能及微炎症反应的作用。方法:采用随机对照的研究方法,以CKD3-5期(非透析)的患者为研究对象,共设计观察50例患者,按照20%的脱落率,将患者分为治疗组与对照组。对照组采用常规治疗,治疗组在常规治疗基础上给予升清降浊胶囊5粒,3次/日,疗程为8周。收集患者年龄、性别、原发病、临床症状等资料,治疗前后均抽血、验尿,留取大便标本。(1)对比两组患者基线临床资料、中医症状积分、肾功能指标、微炎症指标,明确升清降浊胶囊对CKD患者临床症状、肾功能及微炎症反应的影响。(2)对比两组患者的肠道物理屏障指标IS、LPS,免疫屏障指标粪便sIgA,明确升清降浊胶囊对CKD患者肠道屏障功能的影响。结果:共入选患者60例,最终52例完成试验,对照组24例,治疗组28例。(1)升清降浊胶囊对CKD患者中医症状的影响:比较治疗前后两组患者的中医证候症状积分,结果示治疗组治疗后较治疗前、对照组治疗后积分明显降低(P<0.05)。治疗组治疗前后积分差值明显高于对照组(P<0.05)。而对照组治疗前后积分差异无统计学意义(P>0.05)。进一步分析升清降浊胶囊对胃肠道症状的影响,结果示治疗组治疗后“食少纳呆”、“恶心呕吐”、“脘腹胀满”症状与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),“食少纳呆”、“脘腹胀满”与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗组治疗后上述症状严重程度明显低于对照组及治疗前。(2)升清降浊胶囊对CKD患者安全性指标的影响:治疗后对照组及治疗组患者的ALT、AST、K等指标差异均无统计学意义(P>0.05),且治疗组治疗后与对照组治疗后比较,以上指标差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)升清降浊胶囊对CKD患者血生化指标的影响:治疗后对照组及治疗组患者的Hb、ALB、TG、TC、Ca、P、PTH、TCO2等指标差异均无统计学意义(P>0.05),且治疗组治疗后与对照组治疗后比较,以上指标差异无统计学意义(P>0.05)。而治疗组治疗后UA较对照组治疗后明显下降(P<0.05),同时较治疗前明显下降(P<0.05)。(4)升清降浊胶囊对CKD患者肾功能的影响:治疗组治疗后ACR及UA均较对照组治疗后明显下降(P<0.05)。虽然治疗组治疗后eGFR较治疗前及对照组治疗后差异无统计学意义(P>0.05),但治疗组治疗后eGFR差值明显大于对照组(P<0.05)。(5)升清降浊胶囊对CKD患者微炎症反应的影响:治疗组治疗后的IL-6、TNF-α均较治疗前明显降低(P<0.05);且明显低于对照组治疗后(P<0.05)。两组的CRP治疗前后差异均无统计学意义(P>0.05)。(6)升清降浊胶囊对CKD患者肠道屏障功能的影响:治疗组治疗后的IS、LPS均较治疗前明显降低(P<0.05);且明显低于对照组治疗后(P<0.05)。两组的粪便sIgA治疗前后差异均无统计学意义(P>0.05)。将治疗前粪便sIgA与eGFR进行相关性分析,发现二者为正相关关系。比较不同CKD分期的治疗前粪便sIgA的量,组间差异有统计学意义(P<0.05),其中以CKD5期患者粪便sIgA的量最少。比较不同CKD分期下两组粪便sIgA的量,发现治疗后CKD5期治疗组的粪便sIgA较治疗前明显升高(P<0.05),且明显高于对照组治疗后(P<0.05)。结论:明确升清降浊胶囊有保护CKD患者的肠道屏障功能、减轻微炎症反应的作用,发现其还有降血尿酸的效果,为进一步推广其使用提供临床证据。同时也发现粪便sIgA的量随着CKD的进展而越来越少。第二部分实验研究目的:通过实验研究阐明升清降浊胶囊治疗慢性肾脏病作用机制,基于肠肾轴理论及肠道TLRs/NF-κB信号转导通路进一步探讨升清降浊胶囊的作用靶点,为升清降浊胶囊治疗CKD提供依据。方法:建立5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭模型,设立正常组、假手术组、模型组及升清降浊胶囊治疗组,每组均纳入5只大鼠进行试验及检测。从造模成功后第2天开始干预,共干预8周。干预结束后采血、留24小时尿、粪便,留取肾脏、回肠、结肠组织。(1)对比不同分组大鼠的血肌酐、尿素、24小时尿蛋白定量;对大鼠肾组织进行病理HE、Masson染色,对比不同分组的肾脏纤维化程度。(2)采用ELISA法检测大鼠血清IL-6、TNF-α、IS、LPS,粪便sIgA,对比不同分组大鼠各项指标的水平,分析各项指标的相关性。(3)对大鼠肠黏膜进行光镜检查,对比不同分组的肠道病理改变;采用Western-blot法对比不同分组大鼠肠黏膜紧密连接蛋白claudin-1、occludin、ZO-1的表达;采用Real-time PCR技术检测肠道组织TLR2、TLR4,以及TLRs/NF-κB信号转导通路上的关键蛋白MyD88、NF-κB的mRNA表达,对比不同分组大鼠各蛋白的mRNA表达水平;分析其与肠黏膜紧密连接蛋白、微炎症指标的关系。结果:(1)升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾功能的影响:在肾功能指标方面,模型组及治疗组的血肌酐、尿素明显高于正常组(P<0.05),而假手术组与正常组差异无统计学意义(P>0.05);治疗组血肌酐、尿素明显低于模型组(P<0.05)。24小时尿蛋白定量方面,模型组、治疗组较正常组明显升高(P<0.05),而治疗组明显低于模型组(P<0.05)。肾脏病理方面,HE染色见正常组、假手术组肾脏组织细胞基本正常,而模型组可见明显的慢性纤维化表现,治疗组的肾脏病理改变较模型组明显改善;Masson染色半定量分析结果示模型组、治疗组肾脏间质纤维化程度明显较正常组、假手术组严重(P<0.05);治疗组较模型组肾间质纤维化程度明显减轻(P<0.05);治疗组较模型组的肾间质纤维化评分下降约70.5%。(2)升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠微炎症的影响:假手术组、模型组的IL-6、TNF-α水平均明显高于正常组(P<0.05);假手术组、治疗组明显低于模型组(P<0.05);且治疗组与正常组差异无统计学意义(P>0.05)。模型组的IS、LPS水平均明显高于正常组及假手术组(P<0.05);治疗组的IS、LPS水平较模型组明显降低(P<0.05);而在假手术组、治疗组与正常组间差异均无统计学意义(P>0.05)。各组粪便sIgA差异无统计学意义(P=0.307)。Pearson相关性分析示LPS与IL-6、TNF-α成正相关关系;IS与IL-6、TNF-α成正相关关系。(3)升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肠道屏障的影响:肠道病理HE染色见模型组较正常组及假手术组小肠绒毛稀疏、缩短,腺体增殖不活跃;结肠黏膜层水肿,固有层组织疏松、炎症浸润严重。而治疗组的回肠组织、结肠组织均较模型组明显改善。Western-blot法检测肠道组织紧密连接蛋白的表达,模型组的三个TJP表达均低于正常组及假手术组(P<0.05)。而治疗组三个TJP的表达均明显高于模型组(P<0.05)。RT-PCR方法检测肠道组织的TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达水平,模型组的TLR2 mRNA表达明显低于正常组、假手术组及治疗组(P<0.05),治疗组的TLR2 mRNA表达量与正常组差异无统计学意义(P>0.05)。模型组的TLR4 mRNA表达量与正常组差异无统计学意义(P>0.05),而假手术组及治疗组TLR4 mRNA表达量均明显高于模型组(P<0.05)。模型组、假手术组的MyD88、NF-κB mRNA表达量均明显高于正常组(P<0.05),治疗组的MyD88、NF-κB mRNA表达量则均明显低于模型组(P<0.05)。将TJP的代表ZO-1与肠源性毒素IS、LPS及TLR2、TLR4 mRNA表达量进行Pearson相关性分析,结果示ZO-1与IS、LPS呈负相关,与TLR2 mRNA表达量呈正相关,与TLR4 mRNA表达量无明显相关性(P>0.05)。将TLR4 mRNA表达量与微炎症指标IL-6、TNF-α进行相关性分析,发现均无明显相关性(P>0.05)。将NF-κB mRNA表达量与微炎症指标IL-6、TNF-α及ZO-1进行相关性分析,结果示NF-κB mRNA表达量与IL-6、TNF-α呈正相关,与ZO-1呈负相关。结论:证明升清降浊胶囊可延缓5/6肾切除大鼠肾小管间质纤维化、减轻微炎症反应,减少循环中的肠源性毒素LPS、IS,修复肠道屏障功能。并最终验证了升清降浊胶囊是通过调控TLRs/NF-κB信号转导通路,从而起到肾脏保护作用这一假说。阐明升清降浊胶囊治疗CKD的更深层机制,而且其作用是多靶点、多层次的。