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第一部分LRIG2的表达水平与胶质瘤免疫微环境中浸润主要免疫细胞亚群及患者预后的相关性目的:探讨胶质瘤中LRIG2的表达水平与胶质瘤免疫微环境中主要浸润的免疫细胞亚群及患者生存期的相关性。方法:通过网站http://gliovis.bioinfo.cnio.es/分析CGGA数据库中LRIG2的m RNA水平,胶质瘤免疫微环境中免疫细胞亚群浸润程度（肿瘤相关巨噬细胞标记物:CD68;CD4阳性T细胞标记物:CD4;CD8阳性T细胞标记物:CD8;辅助性T细胞标记物:FOXP3）及患者生存期的相关性;将2016年到2019年收集的85份临床病理确诊为胶质瘤的石蜡包埋样本制成组织芯片（I级1例,II级26例,II-III级4例,III级10例,III-IV级4例,IV级40例）,切片,行LRIG2,CD68,CD4,CD8,FOXP3的免疫组化染色。组织化学评分进行量化,H分数=（弱阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数×1）+（中度阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数×2）+强阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数×3),其中深棕色为强阳性,棕黄色为中度阳性,浅黄色为弱阳性,蓝色细胞核为阴性。Kaplan-Meier生存曲线分析LRIG2及主要免疫细胞亚群标记物的表达水平与患者总生存时间的相关性,使用Log-rank检验进行统计分析。结果:在m RNA水平,我们发现在胶质瘤中LRIG2与CD68阳性的肿瘤相关巨噬细胞及CD4阳性T细胞的浸润程度呈正相关,与CD8阳性T细胞及FOXP3阳性的辅助性T细胞无明显相关性。临床胶质瘤组织芯片中的结果与数据库中类似,LRIG2蛋白表达水平高的胶质瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞及CD4阳性T细胞的水平浸润水平更高,但与CD8阳性T细胞及FOXP3阳性的辅助性T细胞无明显相关性,且与肿瘤相关巨噬细胞浸润相关程度更高,差异具有统计学意义。根据m RNA及蛋白水平的高低进行生存期的统计分析,结果显示LRIG2m RNA及蛋白水平高表达,CD68阳性肿瘤相关巨噬细胞及CD4阳性T细胞浸润水平越高的患者,预后更差。在m RNA水平进行分类统计,CD8阳性T细胞浸润程度越高,患者预后越差。在蛋白水平进行分类统计,FOXP3阳性辅助性T细胞浸润程度越高,患者预后越差。结论:在胶质瘤中,LRIG2高表达与肿瘤相关巨噬细胞及CD4阳性T细胞浸润程度呈正相关,且预示着患者的不良预后。第二部分体内实验验证LRIG2敲低后对胶质瘤免疫微环境中肿瘤相关巨噬细胞及胶质瘤的影响目的:在体内进一步探讨敲低LRIG2后对肿瘤相关巨噬细胞浸润水平,肿瘤大小以及荷瘤小鼠生存期的影响。方法:在鼠胶质瘤细胞系GL261中敲低LRIG2,通过WB,PCR验证干扰效率后,进行颅内原位成瘤实验,生物发光成像明确是否影响肿瘤大小后,取出部分小鼠颅内胶质瘤组织,通过流式细胞术及免疫组织化学（IHC）明确LRIG2敲低以后微环境中肿瘤相关巨噬细胞的密度,剩余小鼠利用Kaplan-Meier生存曲线进行生存时间统计。结果:与对照组（GL261sh SCR）相比,LRIG2敲低（GL261SH1,GL261SH2）后,明显抑制肿瘤的生长,IHC染色的分析及流式细胞术提示,与对照组相比较,CD68阳性及F4/80阳性的肿瘤相关巨噬细胞在微环境中的浸润数量明显减少,且荷瘤小鼠的生存时间显著延长。结论:在GBM中,敲低LRIG2能降低肿瘤相关巨噬细胞的浸润,抑制肿瘤的生长,显著延长荷瘤小鼠的生存期。第三部分体外实验验证LRIG2及s LRIG2对肿瘤相关巨噬细胞趋化功能的影响及机制目的:在体外进一步探讨LRIG2及s LRIG2对肿瘤相关巨噬细胞趋化能力是否有影响以及可溶性s LRIG2蛋白从LRIG2蛋白上脱落的机制。方法:首先在构建的过表达LRIG2全长（LRIG2）及胞外段蛋白（s LRIG2）以及敲低LRIG2的GL261,U87细胞系中,收集条件培养基后,在Transwell小室中与巨噬细胞RAW264.7及THP-1共培养后,检测其对巨噬细胞趋化能力的影响;利用M2 FLAG磁珠免疫沉淀过表达LRIG2及s LRIG2胶质瘤细胞来源的条件培养基中s LRIG2后,再次检测其对趋化能力的影响;体外合成原核表达s LRIG2融合蛋白后检测其活性,并进一步验证其对巨噬细胞趋化能力的影响;加入ADAM17激活剂及抑制剂/si RNA调控过表达LRIG2的胶质瘤细胞系中ADAM17的表达后通过WB检测条件培养基中s LRIG2的含量。结果:与对照组相比,过表达LRIG2及s LRIG2的U87及GL261细胞系中的条件培养基对巨噬细胞THP-1及RAW264.7的趋化现象更明显,且与过表达LRIG2的胶质瘤细胞相比,过表达s LRIG2来源的条件培养基显著增强巨噬细胞的趋化能力;而敲低U87及GL261中的LRIG2后,巨噬细胞趋化能力减弱;在加入外源性的s LRIG2重组蛋白后,巨噬细胞THP-1及RAW264.7的趋化能力显著增强,差异具有统计学意义;加入不同浓度的激活剂PMA后,胞质中ADAM17的蛋白表达水平升高,LRIG2的表达水平降低,同时分泌到上清中的s LRIG2也增多,其中200ng/ml的PMA对ADAM17的激活作用最强,分泌到上清中的s LRIG2含量也最多。当加入ADAM17的抑制剂TAPI-1后,可以明显抑制上清中s LRIG2的含量,并且抵消PMA诱导的s LRIG2的脱落。敲低胶质瘤细胞中ADAM17后,分泌到上清中的s LRIG2含量减少。结论:ADAM17可以促进s LRIG2的脱落,s LRIG2具有趋化巨噬细胞的能力。第四部分体外实验验证LRIG2对肿瘤相关巨噬细胞吞噬功能的影响及机制目的:探讨在胶质瘤细胞中LRIG2对肿瘤相关巨噬细胞吞噬功能的影响以及调控肿瘤相关巨噬细胞吞噬功能的分子机制。方法:在胶质瘤细胞系U87及GL261中敲低LRIG2后与巨噬细胞混合培养,通过流式细胞术及荧光显微镜评估巨噬细胞对胶质瘤细胞的吞噬能力;在CGGA数据库及临床胶质瘤组织芯片中明确LRIG2与肿瘤相关巨噬细胞吞噬免疫检查点CD47的表达相关性后,通过WB及RT-q PCR验证U87及GL261中敲低LRIG2后CD47的表达差异;收集过表达LRIG2的U87及GL261的条件培养基后培养巨噬细胞THP-1及RAW264.7后,WB检测CD47配体SIRPα的表达差异;在过表达LRIG2的U87及GL261细胞中敲低CD47,在巨噬细胞THP-1及RAW264.7中敲低SIRPα后,分别将胶质瘤细胞与巨噬细胞混合培养后流式细胞数及荧光显微镜检测巨噬细胞的吞噬功能。结果:与对照组相比,在U87及GL261中敲低LRIG2后,巨噬细胞对胶质瘤细胞的吞噬指数增高;在CGGA数据库以及临床胶质瘤组织芯片中,LRIG2与CD47的m RNA及蛋白表达水平呈正相关,且在U87及GL261中敲低LRIG2后,胶质瘤中CD47的蛋白表达水平降低;巨噬细胞在过表达LRIG2的胶质瘤细胞条件培养基的作用下,SIRPα的蛋白表达水平升高;胶质瘤细胞U87及GL261中过表达LRIG2以后,与对照组相比较,巨噬细胞的吞噬指数降低,而敲低过表达LRIG2胶质瘤细胞中的CD47以及巨噬细胞中SIRPα后,巨噬细胞的吞噬指数相对升高。结论:LRIG2能够通过调控CD47/SIRPα轴来抑制巨噬细胞的吞噬功能。