研究背景：随着社会经济的发展和生活水平的提高,人类的平均预期寿命显著延长,与之相对应的是,心脏疾病如冠心病的发病率也逐年升高。冠心病和心肌梗死所造成的心肌不可逆性损伤是严重威胁全世界健康的杀手。如何有效的让心肌再生是一个非常有价值的研究课题。我们知道斑马鱼和蝾螈等低等脊椎动物成年期心脏如果切除15%左右,它们能在非常短的时间内完全再生出丢失的心肌。哺乳动物的心肌细胞不能分裂的定论在最近10年也被推翻,最近的一项研究发现刚出生的小鼠心肌具有完全再生能力,能够在三周内再生出约10-15%的心肌细胞。出生一周后这种再生能力就会消失。基因图谱研究显示新生小鼠再生出的心肌细胞可能来源于心肌细胞的分裂。不同于新生小鼠,成年鼠和人类的心脏有心肌再生的现象,但是这种心肌再生非常的缓慢,人们想方设法让成熟的心肌细胞快速分裂增殖,只是到目前也还没有确切方法。在生物的进化史上,不管是腔肠动物还是两栖类动物,不管是鸟类还是哺乳类动物,心脏的发育始终由一组核心的转录因子调控。这些转录因子包括NK2,MEF2, GATA, Tbx和Hand,它们调控的基因控制着心脏细胞的分化方向、心肌细胞收缩蛋白的表达以及心脏形态结构的完善等。这些转录因子分工明确,在心脏内按照一定的时间和空间顺序表达,同时这些转录因子相互之间也存在复杂的联系,在一定程度上组成了信号的级联反应,共同调控心脏的发育。在胚胎期,哺乳动物心脏主要由两个特定区域发育而成,分别为第一生心区和第二生心区。第一生心区负责左心室及一小部分心房发育,Nkx2.5是与心肌细胞发育相关最早的标志物,它与Tbx5, Tbx2, Handl等调控第一生心区发育,是形成左心室和部分心房的关键调节点。第二生心区在生物进化史上是个非常特殊的结构,它负责右心室和流出道及部分心房的发育。低等动物如鱼类心脏结构只有单心房,单心室,两栖类则是双心房和单心室,都没有右心室结构。到了哺乳动物,为了适应陆地生活,心脏的结构则变为双心房和双心室。参与第二生心区调控的转录因子有Nkx2.5、lsl1、Foxh1、Tbx20、Gata4.Mef2c、Bop(编码染色质重塑蛋白Smyd)、 Hand2等,其中Isl1是第二生心区特有的标志物。胚胎发育期心脏的形成由诸多因子调控,那么新生小鼠心肌细胞再生时有没有可能启动心脏发育期大量表达的转录因子来完成调控?在低等动物如斑马鱼心肌再生过程中,答案是肯定的。研究者发现转录因子Gata4在心脏损伤后的心肌细胞中重新大量表达,新生的心肌来源于Gata4+的心肌细胞。在哺乳动物血液、骨骼、肝脏、骨骼肌和肾脏等器官都有再生能力。干细胞能够不断增殖和分化,代替这些器官中衰老和死亡的细胞。干细胞有自己比较特异的表面标志物,如酪氨酸激酶受体c-kit,干细胞抗原1(SCA1)等等。人的心脏也不例外,研究认为人的心脏中每三万个细胞中就会有一个c-kit+的原位干细胞。这些原位的干细胞会在心脏损伤后分化成心肌细胞来补充丢失的部分。小鼠心脏干细胞的研究认为小鼠从出生前的胚胎期到出生后的第一天,所有的心肌细胞都是由干细胞分化增殖而来,出生后的大部分时间内,都是干细胞完成心脏损伤后的心肌修复。有研究发现新生小鼠在心梗后的心肌再生也是由c-kit+干细胞来补充完成。研究目的：1.新生小鼠心室不同部位心肌损伤后是否能再生2.明确新生小鼠心肌再生过程中发育相关转录因子的表达情况,比较左右室不同部位损伤后转录因子的表达差异,探寻新生小鼠心肌再生线索。3.研究c-kit+干细胞的在新生小鼠心肌再生过程中的作用。研究方法和结果：第一部分：新生小鼠心室不同部位心肌损伤后的再生过程。小鼠出生后12小时左右行心尖切除术或者右室部分心肌切除术。术后的1,4,7和21天取心脏标本,HE染色检查显示心尖和右室部位心肌的完全再生,Masson染色显示心尖部位无明显疤痕形成。术后21d行心脏超声检查左心室和右心室心功能,结果显示无论是心尖切除还是右室部分切除术后,心功能与对照组相比无明显减低。对新生小鼠术后Ki67的表达情况进行统计。术后1天,对照组每视野Ki67+心肌细胞数为3.2±1,心尖切除后每视野心肌细胞Ki67的表达明显升高,为5.5±1.7(p<0.001)。一周以后(21天)无论手术与否,Ki67+细胞数明显减少。通过免疫荧光染色检查pH3表达情况,术后四天时,手术组1.65±0.12个／视野,非手术组1.18±0.15个／视野(P<0.01)。术后心肌细胞的肌节解聚现象明显。提示大部分心肌再生可能来源于心肌细胞的分裂。第二部分：新生小鼠心肌再生过程中发育相关转录因子表达变化的研究我们选择心脏发育相关转录因子Nkx2.5、Isll、Foxhl、Tbx20、Gata4、Mef2c、 Hand2、c-Myc作为研究对象,利用qRT-PCR检测这些转录因子在出生后不同时间点相对于出生后1天的表达。各转录因子的mRNA表达在出生后均呈明显降低状态。心尖切除术后,与对照组相比,我们发现Mef2c转录因子mRNA表达水平在第1天和第7天较高。免疫组化检测发现术后第四天时心脏细胞核内Mef2c的表达增加。Western结果显示术后第1天和第4天Mef2c蛋白表达较多。说明Mef2c和心尖切除术后的心脏修复相关。右室部分心肌切除后通过比较发现,Foxhl和Tbx20的mRNA和蛋白表达明显升高,而在心尖切除术后却未见这种变化。这些结果说明新生小鼠不同心室部位心肌损伤后转录因子的表达有差异,左右室心肌再生机制可能不同。第三部分：新生小鼠心尖切除术后原位干细胞的增殖研究新生小鼠心尖切除后,我们将切除组和假手术组进行了比较。运用免疫荧光染色的方法进行c-kit+细胞的计数,单位为个/mm2。c-kit基因表达采用qPCR和western方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测。研究结果显示,新生小鼠心尖在切除后21天内能完全再生。c-kit+细胞数术后明显增多,术后1天时手术组每视野c-kit+细胞数为8.38个/mm2,对照组为3.71个/mm2(p<0.05)。c-kit+细胞增多的同时可见部分细胞表达心肌细胞特异标志物cTnT。qRT-PCR和Western实验显示c-kit基因表达及蛋白合成也明显增加。术后一天心脏细胞双染(c-kit/CD45)流式细胞分析结果显示增多的c-kit+细胞主要为心脏原位干细胞。因此,c-kit+心脏祖细胞可能是心肌再生的来源之一。结论：新生小鼠心脏不同部位心肌在损伤后能够完全再生。小鼠心脏左心室和右心室在再生过程中转录因子的表达有明显差异,因此左右心室的心肌再生机制可能不同。c-kit+心肌祖细胞也可能是新生小鼠心肌细胞增殖的来源之一。心肌再生过程中祖细胞增殖与不同转录因子区域性表达的关系还不明确,明确这些转录因子表达差异的原因对心肌再生机制的研究具有重要意义。