丝状真菌由于具有与细菌、酵母不同的独特优点:具有与高等真核生物类似的很强的蛋白外分泌能力,能够进行正确的各种翻译后加工,因此被广泛应用于外源蛋白的高效表达。其中黑曲霉有较高的安全性可以被用于食品药品等领域,成为研究的热点。工业用脂肪酶的重要来源之一是微生物来源的脂肪酶,本实验室筛选到的一株产脂肪酶的米曲霉菌株WZ007,其脂肪酶基因aol（Gen Bank:KP975533）已成功在大肠杆菌表达系统和巴斯德毕赤酵母表达系统进行表达。为了进一步提高的米曲霉脂肪酶基因的表达,本课题尝试利用农杆菌介导的真菌表达系统实现其在黑曲霉中胞外分泌表达,并对其酶学性质进行研究,研究结果如下:1、表达米曲霉脂肪酶基因的黑曲霉工程菌的构建。首先将米曲霉脂肪酶aol目的基因与p CAMBIA-Pgpd A-Tcbh1-hph-Ptrp C载体连接并转化至大肠杆菌E.coli DH5α,筛选出阳性转化子。转化子测序验证后再提取质粒转化至农杆菌AGL-1感受态细胞,再PCR鉴定阳性转化子。将黑曲霉孢子悬浮液与农杆菌于22℃共培养48 h,随后转移到潮霉素B抗性筛选培养基,获得的黑曲霉阳性转化子,提取转化子的基因组并PCR验证。通过黑曲霉工程菌发酵后的酶活性检测,结果表明黑曲霉重组工程菌AN-aol已成功构建。2、黑曲霉工程菌AN-aol的发酵条件优化。首先对黑曲霉菌株表达脂肪酶的发酵条件进行单因素优化,在摇瓶发酵条件为发酵温度为31℃,接种量为7%,初始p H为7.0,摇瓶装液量为110 m L（500 m L摇瓶带挡板）,摇床转速为180r/min,选择的碳源为葡萄糖,添加量是40 g/L,氮源选择蛋白胨与酵母粉的复合氮源,不添加无机盐,使用橄榄油进行发酵诱导,酶活达到217.6 U/m L,相比优化前提高了1.1倍。3、重组脂肪酶AOL的分离纯化研究。黑曲霉发酵液通过高速冷冻离心获得上清液,经10 k Da超滤浓缩,利用阴离子交换层析和疏水作用层析纯化,酶液体积为100μL,蛋白浓度为13 mg/m L,总蛋白量为1.3 mg,总酶活为163.42 U,比酶活为125.71 U/mg。纯化倍数达到65.7倍,酶活的回收率为10.32%。从SDS-PAGE图中看到单一条带,且该条带经过活性染色证明具有脂肪酶活性,表明目的蛋白成功分离纯化达到电泳纯。4、重组脂肪酶AOL的酶学性质研究。实验对脂肪酶的最适温度,最适p H等酶学性质进行研究。实验结果表明脂肪酶最适温度为40℃,在30-45℃温度条件下,具有较好的热稳定性;酶的最适p H为8.0。AOL底物特异性:对C2到C16的不同酰基链长度的对硝基苯基（p NP）酰基酯都具有一定的水解活性,底物特异性对p NP-丁酸（C4）的水解活力最高;金属离子的影响实验结果显示,对AOL的活性都没有明显的激活作用,其中Cu²⁺和Zn²⁺金属离子对AOL酶抑制效果较明显,而对于Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺的耐受性比较好,基本无明显抑制作用。有机溶剂的影响实验结果表明,AOL能在异辛烷和正己烷的存在下被激活。对AOL进行了动力学参数的测定,通过Lineweaver-Burk图获得的K_m和V_max值分别约为3.03 m M和11.40 m M/min/mg。本论文利用黑曲霉表达系统实现米曲霉脂肪酶的成功表达,通过发酵条件的优化,提高了菌株的发酵酶活单位,酶活达到217.6 U/m L。并对重组米曲霉脂肪酶进行了分离纯化和酶学性质研究。本论文的研究为米曲霉脂肪酶的工业化生产提供一定的技术指导。