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背景早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是一种临床综合症,表现为女性在40岁之前出现月经过少或闭经至少4个月,连续两次促卵泡激素水平升高(FSH>25IU/L,两次间隔>4周)和雌二醇(E2)水平降低,严重者表现为生育能力降低甚至不孕。目前临床上常用的激素替代治疗(hormone replacement therapy,HRT)、褪黑素、脱氢表雄酮(DHEA)、饮食和运动等治疗手段都无法从根本上改善卵巢功能,提高患者的生育能力。因此,寻找新的治疗方法来改善患者的卵巢功能,提高其生育能力是目前临床上亟待解决的重要问题。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)属于成体干细胞,具有多向分化潜能和自我更新能力,全球已有大量的动物实验及临床实验证明MSCs可以通过促进卵泡生成,恢复激素水平而修复受损的卵巢功能。然而,MSCs移植面临的致瘤性、免疫源性等问题成为其临床应用的阻碍。间充质干细胞外泌体(Exosomes derived from mesenchymal stem cell,MSC-EXO)是MSCs分泌的一种纳米级细胞外囊泡,据国内外研究报道,MSC-EXO对多种疾病都有治疗作用,可以发挥和干细胞类似的作用,如减少心肌缺血-再灌注损伤、促进脑卒中后神经系统恢复、促进创面愈合等。并且,MSC-EXO作为一种无细胞治疗策略,可以避免干细胞移植所带来的免疫源性、移植后不可控性等问题,这为MSC-EXO的广泛应用带来了巨大的优势。目前,国内外关于间充质干细胞来源的外泌体对POI的实验研究鲜有报道,而MSC-EXO对POI是否具有治疗作用呢?因此,本研究旨在探讨人脐带间充质干细胞来源的外泌体(Human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosomes,Hu MSC-EXOs)是否对POI有治疗作用,为POI的治疗提供一种新型的治疗手段。本研究采用临床上常用的化疗药物环磷酰胺来诱导POI的细胞模型,通过体外实验探讨Hu MSC-EXOs对颗粒细胞损伤是否具有保护作用,为间充质干细胞外泌体治疗POI提供前期实验基础。目的探讨Hu MSC-EXOs对POI是否具有治疗作用,为MSC-EXO治疗POI提供前期实验基础。方法1采用胶原酶消化法获得原代脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,Hu MSCs)进行培养扩增,流式细胞仪上机分析第4代Hu MSCs表面因子CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表达。2收集Hu MSCs培养液上清,超速离心法提取Hu MSC-EXOs。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对Hu MSC-EXOs进行蛋白定量,透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)观察Hu MSC-EXOs的形态学特征,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测Hu MSC-EXOs表面标志物CD81、HSP70、TSG101、Flotillin-1、Calnexin和Lamp-1的表达。3将颗粒细胞分为三组,分别为阴性对照组,阳性对照组和实验组,实验组又依次分为实验组1、2、3、4,阳性对照组和实验组加入环磷酰胺4μg/μl,实验组各组同时依次加入不同浓度的间充质干细胞外泌体,待间充质干细胞外泌体与环磷酰胺损伤的颗粒细胞共培养48h后,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果1 HuMSCs贴壁生长,呈长梭形,培养的P4 HuMSCs的CD73、CD90及CD105呈阳性表达,CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达,符合间充质干细胞表型。2超速离心法提取的Hu MSC-EXOs,肉眼观,Hu MSC-EXOs沉淀在离心管底部,呈白色絮状物。TEM观察到Hu MSC-EXOs直径在30-200nm之间,为圆形或椭圆形的膜性小囊泡,内有低密度电子致密物存在。Western Blot结果显示Hu MSC-EXOs表面标志物CD81、HSP70、TSG101和Flotillin-1表达阳性,Calnexin和Lamp-1表达阴性。3 HuMSC-EXOs与环磷酰胺损伤的颗粒细胞在体外共培养后,其凋亡率明显降低,随着外泌体浓度的增加,颗粒细胞的凋亡率呈下降趋势,且具有剂量依赖性。结论人脐带间充质干细胞来源的外泌体在体外可以减轻环磷酰胺诱导的颗粒细胞损伤,抑制颗粒细胞凋亡,对颗粒细胞起到保护作用。